이 프로토콜은 대부분의 식도 발달 생물학 실험실에서 구현할 수 있으므로 초고해상도 현미경을 사용할 수 없는 연구원도 초고해상도 이미지를 생성할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 연구원들이 샘플 자체를 확장하여 초고해상도 현미경 없이도 기존 컨포칼 현미경의 회절 한계를 우회할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜은 단백질 국소화가 온전한 배아의 세포 형태 또는 기능에 어떻게 영향을 미치는지 연구하는 사람들에게 유용할 것이며, 특히 이러한 단백질이 복잡한 세포 내 구조 또는 네트워크로 조직될 때 도움이 될 것입니다.
사람들이 직면하는 가장 흔한 문제는 프로토콜 전반에 걸쳐 배아를 잃는 것입니다. 배아를 단단히 부착하기 위해 Poly-L-Lysine을 여러 번 코팅하는 것이 좋습니다. 배아 후 3 % 한천으로 절반을 채운 6cm 플라스틱 페트리 접시베이스를 가져 가라.
면도날이나 메스로 한천에 5 x 3cm 직사각형을 꽂습니다. 작은 실험실 주걱을 사용하여 한천 슬래브를 제거합니다. 그런 다음 페트리 접시의 바닥을 뒤집어 벤치에 놓고 거꾸로 된 접시 위에 한천 슬래브를 놓습니다.
페트리 접시에서 뚜껑을 제거하고 건조한지 확인하십시오. 장갑을 사용하여 뚜껑 안쪽에 양면 테이프를 붙입니다. 코팅되고 고정된 배아가 들어 있는 바이알을 셰이커에서 꺼내 작업대에 수직으로 놓습니다.
유기상과 수성이 분리되도록 합니다. 적절하게 고정된 배아는 계면에 남아 있어야 합니다. 파스퇴르 피펫과 P200 피펫을 사용하여 바닥 수성상을 완전히 제거합니다.
라텍스 전구가 장착된 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 고정 배아를 여러 개의 작은 배치로 한천 슬래브에 옮겨 피펫 내부에 달라붙지 않도록 합니다. 배아가 한천 슬래브에 놓이면 P200 피펫터를 사용하여 배아 근처에 남아 있는 헵탄을 제거합니다. 이제 양면 테이프 뚜껑을 2cm 높이에서 한천 슬래브에 떨어뜨려 배아를 테이프에 부착합니다.
한천 슬래브에서 뚜껑을 조심스럽게 제거하고 벤치에 거꾸로 놓고 뚜껑의 배아를 덮을 만큼 충분한 PBS 트윈을 추가합니다. 원하는 배아를 수집하려면 간접 조명으로 100x 배율의 실체 해부 현미경을 사용하십시오. 미세한 유리 바늘로 배아의 앞쪽 또는 뒤쪽 끝 근처에 있는 유리체 막을 찔러 공기를 빼고 압력을 해제합니다.
미세한 집게나 금속 탐침을 사용하여 비텔린 막이 양면 테이프에 부착된 상태에서 구멍을 통해 배아를 부드럽게 밀어냅니다. 원하지 않는 배아를 테이프에 남겨 두십시오. 주기적으로 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 떠다니는 중수소화 배아를 수집하고 1.5밀리리터 미세분리 튜브로 옮깁니다.
50밀리리터 원뿔형 튜브에 PDMS 용액을 준비하고 두 번째 50밀리리터 원추형 튜브에 적절한 양의 물을 추가하여 균형 잡힌 튜브를 만듭니다. PDMS 용액을 섭씨 15도에서 3분 동안 500G에서 원심분리합니다. 그런 다음 10cm 페트리 접시에 1mm 깊이로 붓습니다.
PDMS 용액을 섭씨 55도에서 밤새 응고시킵니다. PDMS 슬래브가 응고되면 메스를 사용하여 22 x 22mm 커버 슬립보다 약간 작은 정사각형 영역에 점수를 매깁니다. 각 사각형 안에 8mm 너비의 사각형 우물에 점수를 매기고 제거합니다.
각 정사각형 PDMS를 22 x 22mm 커버 슬립에 잘 옮기고 단단히 부착합니다. 배아를 커버 슬립에 부착하려면 각 웰 내부의 커버 슬립 표면을 덮을 수 있도록 0.1%Poly-L-Lysine을 충분히 바르고 섭씨 55도 인큐베이터에 넣어 건조시킵니다. 배아와 PBS를 잠시 헹구어 트윈 세제를 제거합니다.
그런 다음 10개 이상의 배아를 코팅된 각 Poly-L-Lysine 웰에 이식합니다. 배아가 우물 바닥에 가라앉도록 합니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 부착된 배아에서 과도한 액체를 제거하고 즉시 다음 단계로 진행합니다.
배아가 단량체 용액에 있는 동안 PDMS 웰을 덮을 겔화 용액을 준비합니다. 분말에서 촉매 산화제를 신선하게 희석하십시오. 3, 920 마이크로 리터의 단량체 용액을 60 마이크로 리터의 10 % TEMED 및 20 마이크로 리터의 1 % TEMPO와 결합하십시오.
겔화 용액을 125마이크로리터 분취액으로 여러 개의 PCR 튜브로 분할합니다. 배아를 파괴하지 않도록 주의하면서 진공 또는 피피터를 사용하여 PDMS 웰에서 단량체 용액을 제거합니다. 5 마이크로 리터의 APS를 겔화 용액이 들어있는 PCR 튜브 중 하나에 첨가하여 중합을 시작합니다.
중합 겔화 용액을 3개의 웰에 빠르게 분배합니다. 모든 우물과 배아가 덮일 때까지 이것을 반복합니다. 샘플을 섭씨 37도에서 1.5-2.5시간 동안 겔화시킵니다.
더 두꺼운 하이드로겔은 중합을 완료하고 응고하는 데 더 오래 걸립니다. 중합을 모니터링하기 위해 하이드로겔을 자주 저어줍니다. 일단 굳으면 하이드로겔이 흔들리지 않습니다.
겔화 후 하이드로겔을 건드리지 않고 커버 슬립에서 PDMS 웰을 벗겨냅니다. 하이드로겔을 개별적으로 6웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 하이드로겔은 소화 중에 약간 팽창할 수 있습니다.
분해 완충액으로 겔을 완전히 덮습니다. 30밀리리터의 소화 완충액은 6웰 접시에 담아 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양하기에 충분합니다. 소화 후 하이드로겔을 6cm 페트리 접시에 옮기고 탈이온수로 채워 팽창시킵니다.
하이드로겔은 이 시점에서 커버 슬립에서 분리되어 선형 치수로 4겹 확장될 수 있습니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 페트리 접시에서 가능한 한 많은 물을 제거하여 취급 시 젤의 움직임을 최소화합니다. 배아가 바닥면에 있는 팽창된 겔을 이미징을 위해 큰 덮개 슬립으로 움직입니다.
각 커버 슬립을 도립 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경의 대물렌즈 위에 젤로 장착합니다. 적절하게 준비되고 배향된 표본을 찾은 후 고배율 오일 또는 물 이멀젼 대물렌즈로 전환하여 고해상도로 이미지를 촬영했습니다. 10x 대물렌즈에서 머리에서 꼬리 축을 따라 배아 길이를 측정한 결과, 확장되지 않은 배아는 시야의 약 1/2에 걸쳐 있는 반면, 확장된 배아는 약 2개의 전체 시야에 걸쳐 있는 것으로 나타났습니다.
확장되지 않은 대조군 배아의 머리에서 꼬리까지의 평균 길이는 398.8마이크로미터였다. 실험 1, 2, 3의 경우, 평균 배아 길이는 각각 4.0배, 4.7배, 4.9배의 팽창 계수였다. 대조 샘플에서 상악 세그먼트의 세포는 평균 너비가 4.76마이크로미터였습니다.
확장된 샘플에서 상악 세그먼트의 세포는 평균 너비가 19.10마이크로미터였으며, 이는 4.0배 팽창을 나타냅니다. actomyosin 세포골격은 수렴 확장을 거친 확장된 배아와 확장되지 않은 대조군에서 이미지화되었습니다. 그들은 이웃 세포가 만나는 곳에서 하나의 선으로 나타났습니다.
대조적으로, 확장된 7단계 배아에서는 세포 세포 접합부에서 미오신 2의 평행선을 관찰할 수 있었는데, 이는 인접한 세포의 피질 단백질 풀을 나타냅니다. 확장되지 않은 6단계 배아에서 스트렙타비딘으로 표지된 미토콘드리아는 명확한 세포 내 세부 사항 없이 이질적인 세포질 연무로 나타났습니다. 그러나 확장된 배아에서는 세포질 내에서 수많은 반점이 분해될 수 있었으며, 이는 조각난 미토콘드리아 또는 미토콘드리아 네트워크의 일부를 나타내는 것으로 보입니다.
이 절차를 시도할 때 기억해야 할 한 가지 중요한 사항은 2차 항체 배양 후 과도한 빛 노출로부터 배아를 보호하는 것입니다.
