Este protocolo muestra el uso de la microscopía de fuerza atómica en modo de contacto para observar cambios en la morfología celular debido a una enfermedad o tratamiento específico. Es muy recomendable utilizar recipientes sellados para este procedimiento para evitar la contaminación y analizar la muestra fija lo antes posible para evitar el envejecimiento. Comience fijando las muestras en el portaobjetos pasando suavemente el portaobjetos sobre una llama varias veces hasta que la muestra esté seca.
Coloque las muestras fijas en una placa de Petri y transpórtelas al equipo de microscopio de fuerza atómica para su observación. A continuación, encienda la computadora y el microscopio de fuerza atómica. A continuación, seleccione el modo de contacto, las sondas ContAI-G y las opciones de pendiente automática en el software.
Establezca los valores predeterminados para el controlador Z estableciendo el punto de ajuste en 20 nanómetros, la ganancia P en 10, 000, la ganancia I en 1, 000, la ganancia D en cero y el voltaje de punta en cero milivoltios. Utilizando el cabezal de rango de escaneo de 70 micrómetros, coloque las muestras en el modo de contacto AFM. Obtenga una vista rápida de la superficie del área debajo de la sonda utilizando una cámara montada en dos lentes integradas en el cabezal de escaneo.
Ahora, elija el área deseada desplazándola manualmente en el plano XY. Permita que la sonda se acerque electrónicamente a la superficie de la muestra hasta que se alcance el contacto. Ajuste electrónicamente el plano de medición XY del escáner y la superficie de la muestra reduciendo la dirección de la pendiente XY.
Establezca los parámetros estándar del software en una línea por segundo y 256 puntos por línea. Luego realice un rango de escaneo completo de un área de 70 por 70 micrómetros. Seleccione el área más pequeña con la herramienta de zoom.
Seleccione una nueva área de la muestra retrayendo el voladizo electrónicamente y moviendo la muestra a lo largo del plano XY. A continuación, realice un nuevo análisis como se demostró anteriormente. A continuación, utilice la nivelación línea por línea en el menú de herramientas de la imagen en la selección de filtros para realizar el procesamiento de datos.
Optimice la altura máxima y mínima en la barra de color para obtener la mejor resolución de imagen. Finalmente, realice el análisis de la imagen utilizando el menú de análisis. Seleccione los puntos inicial y final con la herramienta deseada para determinar la longitud y la distancia.
El análisis microscópico de fuerza atómica de los cultivos bacterianos mostró que los cultivos de Staphylococcus aureus estaban distribuidos por zonas con agregados de cocos. El aumento de las escalas mostró que había una mayor apreciación de la distribución de la población y la morfología de los cocos. Las imágenes del modo de contacto AFM permitieron determinar el tamaño de los cocos que mostraron un ancho promedio de 1,25 micrómetros.
Pseudomonas hunanensis mostró una distribución homogénea en toda la superficie de soporte del vidrio formando una monocapa adherente. Los cultivos tenían forma de varilla con una longitud de 1,9 micrómetros y una anchura de 0,9 micrómetros. La exposición a microdilución de nanopartículas de óxido de magnesio de Staphylococcus aureus resultó en la pérdida de una superficie lisa y contornos homogéneos debido al deterioro severo de la estructura celular.
La formación de vesículas y la liberación de material citosólico se observaron en cultivos a concentraciones más altas que la CMI. Se obtuvieron resultados similares en cultivos de E. coli con los controles mostrando superficies lisas destacando su forma homogénea en forma de varilla. La estructura desapareció por completo a 1.000 PPM de exposición de nanopartículas con solo siluetas distinguibles.
Es importante realizar la fijación de la muestra correctamente, ya que es esencial para un análisis posterior. El filtro de imagen ayuda a proporcionar una buena resolución de imagen y detalles de muestra. Utilizando el método de fijación, se pueden aplicar modos AFM sin contacto, lo que puede ser útil en el estudio de las propiedades mecánicas.
Esta metodología podría ser una herramienta económica y útil para la investigación médica y microbiológica centrada en el análisis del daño celular bacteriano.
