В этом протоколе показано использование атомно-силовой микроскопии в контактном режиме для наблюдения изменений в морфологии клеток из-за конкретного заболевания или лечения. Настоятельно рекомендуется использовать герметичные контейнеры для этой процедуры, чтобы избежать загрязнения, и как можно скорее проанализировать неподвижный образец, чтобы избежать старения. Начните с фиксации образцов на предметном стекле, осторожно проведя предметным стеклом над пламенем несколько раз, пока образец не высохнет.
Поместите фиксированные образцы в чашку Петри и транспортируйте их к оборудованию атомно-силового микроскопа для наблюдения. Далее включаем компьютер и атомно-силовой микроскоп. Затем выберите режим контакта, датчики ContAI-G и параметры автоматического наклона в программном обеспечении.
Установите значения по умолчанию для Z-контроллера, установив заданное значение на 20 нанометров, коэффициент усиления P на 10 000, коэффициент усиления I на 1 000, коэффициент усиления D на ноль и напряжение наконечника на ноль милливольт. Используя 70-микрометровую головку диапазона сканирования, поместите образцы в контактный режим АСМ. Получите быстрый обзор поверхности области под зондом с помощью камеры, установленной на двух объективах, встроенных в сканирующую головку.
Теперь выберите нужную область, вручную переместив ее в плоскость XY. Позвольте зонду электронным способом приблизиться к поверхности образца до тех пор, пока не будет достигнут контакт. Электронная регулировка плоскости измерения XY сканера и поверхности образца, уменьшив направление наклона XY.
Установите стандартные параметры программного обеспечения на одну линию в секунду и 256 точек на линию. Затем выполните полный диапазон сканирования площадью 70 на 70 микрометров. Выделите меньшую область с помощью инструмента масштабирования.
Выберите новую область из образца, втягивая консоль электронным способом и перемещая образец вдоль плоскости XY. Затем выполните новое сканирование, как показано ранее. Далее используйте построчное выравнивание в меню инструментов изображения в выборе фильтра, чтобы выполнить обработку данных.
Оптимизируйте максимальную и минимальную высоту цветовой шкалы, чтобы получить наилучшее разрешение изображения. Наконец, выполните анализ изображения с помощью меню анализа. Выберите начальную и конечную точки с помощью нужного инструмента, чтобы определить длину и расстояние.
Атомно-силовой микроскопический анализ бактериальных культур показал, что культуры золотистого стафилококка распределены по зонам с кокковыми агрегатами. Увеличение масштабов показало, что было более глубокое понимание распределения популяции и морфологии кокков. Изображения контактного режима АСМ позволили определить размер кокков, которые показали среднюю ширину 1,25 микрометра.
Pseudomonas hunanensis показал однородное распределение по всей поверхности стеклянной опоры, образуя адгезивный монослой. Культуры были палочковидной формы длиной 1,9 мкм и шириной 0,9 мкм. Воздействие микроразбавления наночастиц оксида магния золотистого стафилококка приводило к потере гладкой поверхности и однородных контуров из-за сильного разрушения клеточной структуры.
Образование везикул и высвобождение цитозольного материала наблюдались в культурах при более высоких концентрациях, чем МИК. Аналогичные результаты были получены в культурах E.coli, где контрольная группа показала гладкие поверхности, подчеркивающие ее однородную палочковидную форму. Структура полностью исчезла при воздействии наночастиц на 1 000 частей на миллион с различимыми силуэтами.
Важно правильно выполнить фиксацию образца, так как это необходимо для дальнейшего анализа. Фильтр изображений помогает обеспечить хорошее разрешение изображения и детализацию образца. Используя метод фиксации, могут быть применены бесконтактные режимы АСМ, которые могут быть полезны при изучении механических свойств.
Эта методология может быть недорогим и полезным инструментом для медицинских и микробиологических исследований, ориентированных на анализ повреждения бактериальных клеток.
