Este protocolo mostra o uso da microscopia de força atômica em modo de contato para observar alterações na morfologia celular devido a uma doença ou tratamento específico. É altamente recomendável usar recipientes selados para este procedimento para evitar contaminação e analisar a amostra fixa o mais rápido possível para evitar o envelhecimento. Comece fixando as amostras na lâmina, passando suavemente a lâmina sobre uma chama várias vezes até que a amostra esteja seca.
Coloque as amostras fixas em uma placa de Petri e transporte-as para o equipamento de microscópio de força atômica para observação. Em seguida, ligue o computador e o microscópio de força atômica. Em seguida, selecione o modo de contato, as sondas ContAI-G e as opções de inclinação automática no software.
Defina os valores padrão para o controlador Z definindo o ponto de ajuste em 20 nanômetros, ganho de P em 10.000, ganho de I em 1.000, ganho de D em zero e tensão de ponta em zero milivolts. Usando a cabeça do intervalo de varredura de 70 micrômetros, coloque as amostras no modo de contato AFM. Obtenha uma visão rápida da superfície da área sob a sonda usando uma câmera montada em duas lentes integradas à cabeça de digitalização.
Agora, escolha a área desejada deslocando-a manualmente no plano XY. Permitir que a sonda se aproxime eletronicamente da superfície da amostra até que o contato seja alcançado. Ajuste eletronicamente o plano de medição XY do scanner e a superfície da amostra reduzindo a direção da inclinação XY.
Defina os parâmetros padrão do software para uma linha por segundo e 256 pontos por linha. Em seguida, execute uma faixa de varredura completa de uma área de 70 por 70 micrômetros. Selecione a área menor usando a ferramenta de zoom.
Selecione uma nova área da amostra retraindo o cantilever eletronicamente e movendo a amostra ao longo do plano XY. Em seguida, execute uma nova varredura conforme demonstrado anteriormente. Em seguida, use o nivelamento linha por linha no menu de ferramentas da imagem na seleção de filtro para executar o processamento de dados.
Otimize a altura máxima e mínima na barra de cores para obter a melhor resolução de imagem. Por fim, realize a análise das imagens utilizando o menu de análise. Selecione os pontos iniciais e finais com a ferramenta desejada para determinar o comprimento e a distância.
A análise microscópica de força atômica das culturas bacterianas mostrou que as culturas de Staphylococcus aureus estavam distribuídas por zonas com agregados de cocos. O aumento das escalas mostrou maior valorização da distribuição populacional e da morfologia dos cocos. As imagens do modo de contato AFM permitiram a determinação do tamanho dos cocos que apresentaram largura média de 1,25 micrômetros.
Pseudomonas hunanensis apresentou distribuição homogênea em toda a superfície de suporte de vidro, formando uma monocamada aderente. As culturas foram em forma de bastonete, com comprimento de 1,9 micrômetros e largura de 0,9 micrômetros. A exposição por microdiluição de nanopartículas de óxido de magnésio de Staphylococcus aureus resultou na perda de uma superfície lisa e contornos homogêneos devido à grave deterioração da estrutura celular.
A formação de vesículas e a liberação de material citosólico foram observadas em culturas em concentrações mais elevadas que a CIM. Resultados semelhantes foram obtidos em culturas de E.coli, com os controles mostrando superfícies lisas, destacando sua forma homogênea de bastonetes. A estrutura desapareceu completamente com a exposição de nanopartículas de 1.000 PPM apenas com silhuetas distinguíveis.
É importante realizar a fixação correta da amostra, pois ela é essencial para uma análise mais aprofundada. O filtro de imagem ajuda a fornecer boa resolução de imagem e detalhes de amostra. Usando o método de fixação, modos sem contato AFM podem ser aplicados, o que pode ser útil no estudo das propriedades mecânicas.
Esta metodologia pode ser uma ferramenta barata e útil para pesquisas médicas e microbiológicas focadas na análise de danos celulares bacterianos.
