Diese Studie wird unterstützt durch Exploring the Mechanism and Role of the ERK2/Snai1/AGPS/PUFA-PL Pathway in Gastric Cancer Cell's Resistance to Apatinib-Induced Ferroptosis (Artikelnummer: 82172814), unterstützt von der National Nature Science Foundation of China; Untersuchung der Rolle und des Mechanismus des Zinkfinger-Transkriptionsfaktors 1 bei der Modulation der Resistenz von Magenkrebszellen gegen die durch Apatinib induzierte Ferroptose über den mehrfach ungesättigten Ether-Phospholipid-Signalweg (Artikelnummer: 2022A1515010267), unterstützt durch das Komitee der Provinz Guangdong zur Finanzierung der Grundlagen- und angewandten Forschung; und die Erforschung und Anwendung eines Reagenzes für die Diagnose der 5-FU-Chemosensitivität bei Magenkrebs (Artikelnummer: 201903010072), Wissenschafts- und Technologieprojekte in Guangzhou.

Alle Protokolle und die Gewebeproben von Magenkrebs (Schritt 1), die aus der Endoskopie oder Operation des oberen Gastrointestinaltrakts gewonnen wurden und in dieser Studie verwendet wurden, wurden am 24. Juli 2023 von der medizinischen Ethikkommission überprüft und genehmigt (NFEC-2023-298). Darüber hinaus ist dieses Protokoll ausschließlich dazu gedacht, den Nachweis mehrerer Gene bei Magenkrebs zu veranschaulichen, ohne sich an Kohortenvergleichen zu beteiligen, und stellt daher keine spezifischen Kriterien für den Ein- oder Ausschluss von Patienten auf. Die Patienten/Teilnehmer gaben ihre schriftliche Einverständniserklärung zur Teilnahme an dieser Studie ab.
1. Präparation von eingebetteten Magenkrebsblöcken
<ol><li>Konfigurieren Sie das Gewebeeinbettungssystem, bestehend aus einem Paraffinreservoir und einem Spender sowie Warm- und Kaltplatten, gemäß den vorgeschriebenen Betriebsrichtlinien.</li>
	<li>Entnehmen Sie das für die Einbettung vorbereitete Gewebe aus dem Dörrgerät und legen Sie es in den Aufbewahrungsschlitz des Einbettzentrums.</li>
	<li>Wählen Sie die passenden Einbettungsformen basierend auf der Gewebegröße aus, gießen Sie eine ausreichende Menge geschmolzenes Paraffin, um das Gewebe zu bedecken, und positionieren Sie dann die Form auf der Warmplatte.</li>
	<li>Entnehmen Sie das Gewebe aus den Kassetten und platzieren Sie die Magenschleimhaut senkrecht zur Basis der Einbettungsform, um sicherzustellen, dass die Querschnittsebene alle Gewebeschichten durchschneidet. Richten Sie das Tuch in der Form aus.</li>
	<li>Setzen Sie die Kassette auf die Oberseite der Form, gefolgt von einem zweiten Einguss von Paraffin, um die Form zu füllen.</li>
	<li>Legen Sie die eingebettete Form auf die Kühlplatte und brechen Sie nach der Erstarrung des Paraffins die eingebetteten Blöcke von den Formen ab.</li>
</ol>2. Extraktion von Nukleinsäuren aus Proben
<ol><li>Verwenden Sie Nukleinsäure-Extraktions- und Aufreinigungskits, um Nukleinsäuren aus paraffineingebetteten Gewebeproben zu extrahieren.</li>
	<li>Verwenden Sie einen Nukleinsäurequantifizierer, um die extrahierte Nukleinsäure zu quantifizieren. Es wird empfohlen, die Nukleinsäurekonzentration auf mehr als 2 ng/μl zu erhöhen. HINWEIS: Die hier verwendeten Materialien sind in der Materialtabelle verfügbar.</li>
</ol>3. Vorbereitung für die Sequenzierungsbibliothek
<ol><li>Vorbereitung vor dem Experiment<ol><li>Schalten Sie die UV-Lampe in der ultra-cleanen Werkbank ein und sterilisieren Sie sie 30 Minuten lang. Schalten Sie dann die UV-Lampe aus und den Lüfter ein, um 10 Minuten lang zu lüften.</li>
		<li>Nehmen Sie die Nukleinsäure aus dem -20 ± 5 °C-Kühlschrank, überprüfen und notieren Sie die Proben-ID, den Nukleinsäure-Barcode und die spezifische Etikettennummer, die der Probe zugewiesen ist. Legen Sie es zur Auflösung bei Raumtemperatur (RT) nach der Überprüfung auf das Gestell des Zentrifugenröhrchens und zentrifugieren Sie es 10 s lang mit einer festen Dosis von 2.500 x g für den Standby-Modus.</li>
	</ol></li>
	<li>PCR-Amplifikation des Zielfragments<ol><li>Nehmen Sie die Fragment-Capture-Reaktionslösung, den Amplifikationsprimer für Magenkrebs und den Fusionsamplifikationsprimer aus dem speziell angefertigten Multi-Gen-Gelenknachweiskit für Magenkrebs und legen Sie sie zum Schmelzen auf Eis. Nach dem Schmelzen schütteln und mischen, 10 s zentrifugieren und nukleasefreies Wasser zubereiten. Detaillierte Informationen zum Primer sind in Tabelle 1 aufgeführt. HINWEIS: Das Kit ist noch nicht im Handel erhältlich, kontaktieren Sie authotrs für weitere Details.</li>
		<li>Bereiten Sie ein 0,2-ml-PCR-Reaktionsröhrchen vor, geben Sie nacheinander Reagenzien gemäß der ergänzenden Tabelle 1 in das Röhrchen, wirbeln Sie es und mischen Sie es 5 s lang und zentrifugieren Sie sofort 10 s lang mit festen 2.500 x g, so dass keine offensichtlichen Tropfen auf der Röhrchenwand und dem Deckel vorhanden sind. RNA-Proben sollen in cDNA reverse transkribiert und dann für den anschließenden Bibliotheksaufbau verwendet werden. cDNA-Produkte sind gemäß der Ergänzenden Tabelle 2 nacheinander in die Röhrchen zu geben.</li>
		<li>Setzen Sie jedes Reaktionsrohr auf den Thermocycler. Führen Sie für die DNA-Proben das Amplifikationsprogramm aus, wie in Tabelle 2 beschrieben. Führen Sie für cDNA-Produkte das Amplifikationsprogramm wie in Tabelle 3 beschrieben aus.</li>
	</ol></li>
	<li>Aufschluss der Primersequenz<ol><li>Nehmen Sie das Primer-Verdauungsenzym heraus und legen Sie es zum Schmelzen auf Eis. Nehmen Sie nach der Amplifikation die obigen Reaktionsröhrchen heraus, geben Sie 2 μl Primeraufschlussenzym in jedes Röhrchen und stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen 22 μl beträgt.</li>
		<li>Die Reaktionslösung im PCR-Röhrchen vortexen und mischen und sofort 10 s lang zentrifugieren, mit einem festen Wert von 2.500 x g.</li>
		<li>Setzen Sie jedes Reaktionsrohr auf den Thermocycler und führen Sie das Programm wie in Tabelle 4 beschrieben aus.</li>
	</ol></li>
	<li>Ligatur des Adapters<ol><li>Legen Sie den Adapter, der die Reagenzien verbindet, zum Auflösen auf Eis. Bereiten Sie ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen vor, mischen Sie dann jede Komponente gemäß Tabelle 5 und markieren Sie sie als Adaptermischung X. HINWEIS: Zu den Adapterverbindungsreagenzien gehören P1-Adapter und spezifische Adapter X mit den Nummern 1 bis 48. Diese sind so konzipiert, dass sie verschiedene Proben eindeutig kennzeichnen. Wenn Sie einen bestimmten Adapter hinzufügen, öffnen Sie jeweils nur einen Schlauch, um eine Kreuzkontamination des spezifischen Adapters zu vermeiden. Die verdünnte spezifische Adaptermischung kann bei -20 ± 5 °C für den Standby-Modus gelagert werden. In Sequenzierungs-Workflows werden Proben nicht einzeln verarbeitet, sondern mehrere Proben, die jeweils mit einem bestimmten Adapter versehen sind, in einer einheitlichen Bibliothek für die Sequenzierung kombiniert. Diese Methode ermöglicht die nachträgliche Differenzierung von Proben anhand ihrer spezifischen Adaptersequenzen.</li>
		<li>Nehmen Sie das aufgeschlossene Primerprodukt (22 μl) aus dem Thermocycler. Die Reagenzien nacheinander gemäß Tabelle 6 in das Röhrchen geben, vortexen und 5 s lang mischen. Zentrifugieren Sie 10 s lang bei niedriger Geschwindigkeit mit festen 2.500 x g, so dass kein offensichtlicher Tropfen an der Wand und dem Deckel des Röhrchens entsteht.</li>
		<li>Setzen Sie das Reaktionsrohr auf den Thermocycler. Führen Sie für die DNA-Proben das Amplifikationsprogramm aus, wie in Tabelle 7 beschrieben. Führen Sie für cDNA-Produkte das Amplifikationsprogramm wie in Tabelle 8 beschrieben aus.</li>
	</ol></li>
	<li>Reinigung des Ligationsprodukts und Amplifikation<ol><li>Nehmen Sie die magnetischen DNA-Aufreinigungskügelchen vorab aus dem 2-8 °C Kühlschrank, wirbeln Sie sie gleichmäßig und zentrifugieren Sie sie augenblicklich für 10 s, mit einem festen Wert von 2.500 x g. Äquilibrieren Sie die magnetischen Kügelchen bei RT für 30 min.</li>
		<li>Bereiten Sie ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Adsorption vor und übertragen Sie das Produkt der Ligationsreaktion in das entsprechende Röhrchen.</li>
		<li>Geben Sie 45 μl gereinigte DNA-Magnetkügelchen in jedes Röhrchen, wirbeln Sie es ein und mischen Sie es gut, zentrifugieren Sie es sofort für 10 s und inkubieren Sie es 5 Minuten lang bei RT.</li>
		<li>Legen Sie das Rohr für 3 Minuten auf ein Magnetgestell. Entsorgen Sie den Überstand und vermeiden Sie es, die Kügelchen herauszupipettieren.</li>
		<li>Füllen Sie 300 μl neu hergestelltes 75%iges Ethanol in das Mikrozentrifugenröhrchen um und drehen Sie die Röhrchen vorsichtig 4x um 180°. Nachdem die Lösung klar ist, entsorgen Sie schnell den Überstand. Vermeiden Sie es, die Kügelchen herauszupipettieren. Wiederholen Sie den Waschvorgang noch 1x weiter.</li>
		<li>Nehmen Sie die 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen aus dem Magnetgestell und zentrifugieren Sie kurz (10 s, mit festen 2.500 x g). Legen Sie die Röhrchen wieder in das Magnetgestell und pipettieren Sie die restliche Flüssigkeit heraus. Stellen Sie sicher, dass sich keine Flüssigkeitsreste an der Rohrwand befinden.</li>
		<li>Öffnen Sie die Kappe jedes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchens und trocknen Sie die Kügelchen 5 Minuten lang bei RT. Achten Sie auf den trocken-nassen Zustand der Perlen. Überprüfen Sie nach dem Trocknen der Magnetkügelchen, ob sich keine Wasserflecken auf der Oberfläche befinden. Verlängern Sie die Trocknungszeit entsprechend, wenn die Magnetkügelchen zu nass sind. Schließen Sie sofort den Deckel, wenn Risse an den Kügelchen auftreten, und fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, um die Bibliothek zu verstärken und zu reinigen.</li>
	</ol></li>
	<li>Erweiterung und Reinigung der Bibliothek<ol><li>Legen Sie PCR-bezogene Reagenzien zur Auflösung im Voraus auf Eis, wirbeln Sie sie und zentrifugieren Sie sie 10 s lang. Nehmen Sie das 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen aus dem Magnetgestell, pipettieren Sie die PCR-Regenten gemäß Tabelle 9 in das Röhrchen und schließen Sie die Kappe und den Wirbel für 5 Sekunden. Kurz zentrifugieren (10 s), um keinen offensichtlichen Flüssigkeitstropfen auf die Röhrchenwand und den Deckel zu bekommen.</li>
		<li>Übertragen Sie das obige Produkt in ein neues PCR-Röhrchen. Inkubieren Sie die Probe auf einem Thermocycler. Führen Sie für die DNA-Proben das Amplifikationsprogramm aus, wie in Tabelle 10 beschrieben. Führen Sie für cDNA-Produkte das Amplifikationsprogramm wie in Tabelle 11 beschrieben aus.</li>
		<li>Bereiten Sie ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Adsorption vor. Zentrifugieren Sie das PCR-Röhrchen nach der Inkubation 10 s lang. Übertragen Sie das Produkt aus dem PCR-Röhrchen in das EP-Röhrchen.</li>
		<li>Geben Sie 25 μl DNA-gereinigte magnetische Kügelchen in jedes Röhrchen. Vortexen und gut mischen, bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugieren und 5 min bei RT inkubieren.</li>
		<li>Legen Sie die Röhrchen für 3 Minuten auf ein Magnetgestell und warten Sie, bis die Lösung klar wird. Den Überstand in neue Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Vermeiden Sie es, die Kügelchen herauszupipettieren.</li>
		<li>Geben Sie 60 μl aufgereinigte DNA-Magnetkügelchen in jedes Röhrchen. Vortexen und gut mischen, bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugieren und 5 min bei RT inkubieren.</li>
		<li>Legen Sie die Röhrchen für 3 Minuten auf ein Magnetgestell und warten Sie, bis die Lösung klar wird. Entsorgen Sie den Überstand. Vermeiden Sie es, die Kügelchen herauszupipettieren.</li>
		<li>Füllen Sie 300 μL des neu hergestellten 75%igen Ethanols in die Röhrchen um und drehen Sie die Röhrchen vorsichtig 4x um 180°. Nachdem die Lösung klar ist, pipettieren Sie schnell und entsorgen Sie den Überstand. Vermeiden Sie es, die Kügelchen herauszupipettieren. Wiederholen Sie den Waschvorgang 1x.</li>
		<li>Nehmen Sie die 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen aus dem Magnetgestell und zentrifugieren Sie sie kurz (10 s). Setzen Sie die Röhrchen wieder in das Magnetgestell ein und pipettieren Sie die restliche Flüssigkeit heraus. Stellen Sie sicher, dass sich keine Flüssigkeitsreste an der Rohrwand befinden.</li>
		<li>Öffnen Sie die Verschlüsse der 1,5-ml-Röhrchen und trocknen Sie die Kügelchen 5 Minuten lang bei RT. Achten Sie auf den trocken-nassen Zustand der Perlen. Nachdem die Magnetperlen getrocknet sind, gibt es keine Wasserflecken auf der Oberfläche. Verlängern Sie die Trocknungszeit entsprechend, wenn die Magnetkügelchen zu nass sind. Schließen Sie den Deckel sofort, wenn sich Risse an den Perlen bilden.</li>
		<li>50 μl Eluent in die Röhrchen pipettieren, vortexen und gut mischen. Kurz zentrifugieren (5 s, mit festen 2.500 x g) und die Röhrchen für 5 min auf RT stellen.</li>
		<li>Legen Sie die Röhrchen für 3 Minuten auf ein Magnetgestell und warten Sie, bis die Lösung klar wird. Entfernen Sie die Flüssigkeit vorsichtig in ein neues Röhrchen und markieren Sie den Namen der Bibliothek.</li>
		<li>Lagern Sie die Bibliothek vorübergehend im Kühlschrank bei 2-8 °C und warten Sie auf die quantitative Bestimmung oder lagern Sie die Bibliothek zur Langzeitlagerung bei -20 ± 5 °C im Kühlschrank.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Quantifizierung der konstruierten Bibliothek
<ol><li>Verwenden Sie den Nukleinsäurequantifizierer, um die Bibliothek zu quantifizieren. Wenn die Bibliothekskonzentration ≥ 0,2 ng/μL beträgt, ist sie qualifiziert. Andernfalls erstellen Sie die Bibliothek neu.</li>
	<li>Mischen Sie das gleiche Volumen an DNA (oder RNA) und quantifizieren Sie die Lösung. Je nach quantitativem Ergebnis verdünnen Sie die gemischte Lösung auf 100 pmol/l nach der folgenden Formel. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66058/66058eq01.jpg" style="margin: auto;"> HINWEIS: Eine Alternative besteht darin, die Bibliothek gemäß der Formel auf 100 pmol/l zu verdünnen und dann durch quantitative Fluoreszenz-PCR zu quantifizieren. Mischen Sie DNA(- oder RNA)-Bibliotheken gleichermaßen entsprechend den quantitativen Ergebnissen des PCR-Instruments.</li>
	<li>Mischen Sie 100 pmol/L DNA-Bibliothek und RNA-Bibliothek im Verhältnis 4:1. Verwenden Sie die gemischte Lösung aus DNA- und RNA-Bibliothek für die Computersequenzierung.</li>
</ol>5. Sequenzierung
<ol><li>Führen Sie die Sequenzierung durch, indem Sie sich auf das Handbuch des universellen Kits für die Sequenzierungsreaktion24, 25 (Halbleiter-Sequenzierungsmethode) beziehen.</li>
</ol>6. Qualitätskontrolle der Proben
<ol><li>Positive Qualitätskontrolle der Magenkrebs-DNA: Nehmen Sie die DNA-Positivkontrolle von Magenkrebs und führen Sie den Test gemäß den Anweisungen des Kits durch. Die Steuerung wird mit dem Kit mitgeliefert. Das Ergebnis zeigt, dass MTHFR-, DHFR-, MTR-, GGH- und SLC19A1-Genmutanten nachgewiesen werden können.</li>
	<li>Negative Qualitätskontrolle der Magenkrebs-DNA: Nehmen Sie die DNA-Negativkontrolle von Magenkrebs und führen Sie den Test gemäß den Anweisungen des Kits durch. Die Steuerung wird mit dem Kit mitgeliefert. Das Ergebnis zeigt, dass die Wildtypen der Gene MTHFR, DHFR, MTR, GGH und SLC19A1 nachgewiesen werden. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Kriterien in beiden Fällen erfüllt sind, andernfalls ist eine erneute Erkennung erforderlich.</li>
</ol>7. Datenanalyse
<ol><li>Führen Sie das entsprechende Plug-In (die Software Variant Caller, Coverage Analysis und Ion Reporter) in der Torrent Suite-Software aus, um die Analyseergebnisse der Proben zu erhalten. Beurteilen Sie die Ergebnisse der Probenerkennung anhand der Analyseergebnisse des Plug-ins.</li>
</ol>

SNP-gesteuerte 5-FU-Therapie bei Magenkrebs mittels Ionenstrom-Sequenzierung

<ol>
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Thermofisherscientific Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0015805_Ion520_530ExTKit_UG.pdf">https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0015805_Ion520_530ExTKit_UG.pdf</a> (2023)</li><li>Ion genestudio s5 instrument user guide. Thermofisherscientific Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0017528_Ion_GeneStudio_S5_Instrument_UG.pdf">https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0017528_Ion_GeneStudio_S5_Instrument_UG.pdf</a> (2023)</li><li>Parkin, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-laboratory+comparison+of+next-generation+to+sanger-based+sequencing+for+hiv-1+drug+resistance+genotyping.">Multi-laboratory comparison of next-generation to sanger-based sequencing for hiv-1 drug resistance genotyping.</a> Viruses. 12 (7), 694 (2020).</li><li>Ziller, M. J., Hansen, K. D., Meissner, A., Aryee, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coverage+recommendations+for+methylation+analysis+by+whole-genome+bisulfite+sequencing.">Coverage recommendations for methylation analysis by whole-genome bisulfite sequencing.</a> Nat Methods. 12 (3), 230-232 (2015).</li><li>Lordick, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unmet+needs+and+challenges+in+gastric+cancer:+The+way+forward.">Unmet needs and challenges in gastric cancer: The way forward.</a> Cancer Treat Rev. 40 (6), 692-700 (2014).</li><li>Kumar, K. R., Cowley, M. J., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+and+emerging+technologies.">Next-generation sequencing and emerging technologies.</a> Semin Thromb Hemost. 45 (7), 661-673 (2019).</li><li>Chinese Centres for Disease Control and Prevention. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ministry+of+Health+of+the+People's+Republic+of+China.+WS+233-2002.">Ministry of Health of the People's Republic of China. WS 233-2002.</a> Chinese Centres for Disease Control and Prevention. , 1-64 (2002).</li><li>China Environmental Protection Industry. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+waste+management+regulations.">Medical waste management regulations.</a> China Environmental Protection Industry. (1), 6-10 (2004).</li></ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Klinische Experten sind sich einig, dass Patienten auch mit der gleichen Art und dem gleichen Stadium von Magenkrebs deutlich unterschiedlich auf einen identischen Behandlungsansatz ansprechen können. Jahrelange Forschung hat den Wissenschaftlern gezeigt, dass die individuellen Variationen hauptsächlich auf die Natur des Magenkrebses als heterogene, polymorphe und vielfältig differenzierte Zellpopulation zurückzuführen sind, was zu erheblichen individuellen Unterschieden im Ansprechen auf die Behandlung führt28. Folglich ermöglicht die Gewinnung von Magenkrebsproben durch eine Endoskopie des oberen Gastrointestinaltrakts oder eine Operation und Blutproben, gekoppelt mit einer Hochdurchsatzsequenzierung für die genetische Analyse, eine personalisierte Magenkrebsbehandlung. Diese Strategie zielt darauf ab, die Wirksamkeit der klinischen Behandlung zu verbessern und das Risiko schwerer toxischer Nebenwirkungen zu verringern. Die Fortschritte in der Ionen-Halbleiter-Sequenzierungstechnologie haben die personalisierte Behandlung in die Praxis umgesetzt29.
Hier sind einige Einschränkungen dieser Testmethode. Das hier verwendete Kit ist in erster Linie für die In-vitro-Diagnostik bestimmt, daher beschränkt es sich auf den Nachweis der Mutation von rs1801131 und rs1801133 des MTHFR-Gens , rs1650697 und rs442767 des DHFR-Gens , rs1805087 des MTR-Gens , rs11545078 des GGH-Gens und rs1051298 von SLC19A1. Mutationen in anderen Abschnitten können nicht nachgewiesen werden. Aufgrund der signifikanten Heterogenität des Tumorgewebes können unterschiedliche Probenahmeorte die Nachweisergebnisse beeinflussen. Bei in Paraffin eingebetteten Gewebeproben, die länger gelagert werden, können DNA und RNA bis zu einem gewissen Grad abgebaut werden, was sich auf die Testergebnisse auswirkt. Eine unangemessene Probenentnahme, ein unangemessener Transport und eine unangemessene Verarbeitung von Proben sowie ein unsachgemäßer Versuchsbetrieb und eine unsachgemäße Versuchsumgebung können zu falsch negativen oder falsch positiven Ergebnissen führen. Das Nachweisergebnis kann nicht garantiert werden, wenn die Nukleinsäurekonzentration unter 2 ng/μl liegt. Die Testergebnisse des Kits dienen nur als klinische Referenz. Die Auswahl einer personalisierten Behandlung für Patienten sollte in Kombination mit ihren Symptomen/Anzeichen, ihrer Krankengeschichte, anderen Labortests und Behandlungsreaktionen in Betracht gezogen werden. Negative Ergebnisse können das Vorhandensein einer Zielgenmutation nicht vollständig ausschließen. Negative Ergebnisse können auch durch zu wenige Tumorzellen in der Probe, einen übermäßigen Abbau der Nukleinsäure oder die Konzentration des Zielgens im Amplifikationsreaktionssystem unterhalb der Nachweisgrenze verursacht werden.
Einige Leistungsindizes des verwendeten Kits sind wie beschrieben. Analytische Sensitivität: Bei DNA-Proben beträgt die minimal nachweisbare Menge der gesamten Nukleinsäure in diesem Kit 10 ng, und es kann eine Mutationsrate von 5 % nachgewiesen werden. Für RNA-Proben beträgt die minimal nachweisbare Menge der gesamten Nukleinsäure in diesem Kit 10 ng. Positive und negative Koinzidenzrate: Die positive und negative Koinzidenzrate erreicht 100%. Nachweisgrenze (LOD): Insgesamt können 14 LOD-Referenzen mit den Nummern L1-L14 verwendet werden. L1-L11 sind LOD-Referenzen von MTHFR-, DHFR-, MTR-, GGH - und SLC19A1 Genen, und ihre Nachweisergebnisse sollten sein, dass die Mutationstypen der entsprechenden Genstellen positiv sind und die Koinzidenzraten 100% betragen. Wiederholgenauigkeit: Es können insgesamt fünf sich wiederholende Referenzmaterialien mit den Nummern R1-R5 verwendet werden. R1 ist ein stark positives, repetitives Referenzmaterial (rs67376798 Mutation des DPYD-Gens ). R2, das diese Mutation in geringerer Anzahl enthält, ist ein schwach positives repetitives Referenzmaterial (rs67376798 Mutation des DPYD-Gens ), R3 ist ein negatives repetitives Referenzmaterial (6 Stellen der Gene DPYD, MTHFR und ABCB1 werden als Wildtyp nachgewiesen). Jede Referenzprobe muss 10 Mal getestet werden, wobei sicherzustellen ist, dass die Ergebnisse dieser wiederholten Bewertungen mit den vordefinierten Klassifizierungen übereinstimmen. Datenvolumen: Das effektive Datenvolumen von DNA- und RNA-Proben sollte über 0,05 M kontrolliert werden. Die Sequenzierungstiefe von DNA-Proben ist oberhalb von 500 zu kontrollieren, und die Mapped Reads von RNA-Proben sind über 20000 zu kontrollieren. Interferenztest: Dieses Kit wird nicht durch endogene Störstoffe (Triglyceride und Albumin) und exogene Störstoffe (Formalin und dehydrierter Alkohol) beeinflusst.
Während des Versuchs müssen einige Vorsichtsmaßnahmen beachtet werden. Das hier verwendete Kit kann nur für In-vitro-Tests verwendet werden. Bitte lesen Sie diese Anleitung vor dem Experiment sorgfältig durch und verwenden Sie sie innerhalb der Gültigkeitsdauer. Komponenten des Kits in verschiedenen Chargen können nicht austauschbar verwendet werden. Es wird empfohlen, für dieses Kit Einweg-Verbrauchsmaterialien zu verwenden, um eine Kontamination zu vermeiden. Während der Verwendung dieses Kits wird empfohlen, einen Saugkopf mit einem Filterelement zu verwenden. Um mögliche biologische Gefahren in der Probe zu vermeiden, sollte die Probe als infektiöse Substanz betrachtet werden, um den Kontakt mit Haut und Schleimhaut zu vermeiden. Es wird empfohlen, die Proben in einer Biosicherheitswerkbank zu behandeln, die den Austritt von Aerosolen verhindern kann. Reagenzgläser und Saugnäpfe, die bei der Operation verwendet werden, sollten sterilisiert werden, bevor sie verworfen werden. Der Betrieb und die Entsorgung der Proben müssen den Anforderungen der einschlägigen Gesetze und Vorschriften entsprechen: Allgemeine Richtlinien für die biologische Sicherheit mikrobieller biomedizinischer Laboratorien und Vorschriften für die Entsorgung medizinischer Abfälle des Gesundheitsministeriums30,31. Das Versuchspersonal muss eine professionelle Ausbildung erhalten, streng nach den Anweisungen arbeiten und die Bereiche entsprechend dem Versuchsprozess strikt voneinander trennen. In jeder Phase des Versuchsbetriebs sind spezielle Instrumente und Ausrüstungen zu verwenden, und die Gegenstände in jeder Phase jedes Bereichs dürfen nicht austauschbar verwendet werden. Das Versuchspersonal muss die Bereiche entsprechend dem Versuchsablauf strikt voneinander trennen. In jeder Phase des Versuchsbetriebs sind spezielle Instrumente und Ausrüstungen zu verwenden. Ergreifen Sie bei Bedarf Schutzmaßnahmen wie Handschuhe, Arbeitskleidung usw. Bei der Abfallentsorgung sind die einschlägigen nationalen Vorschriften einzuhalten.
Obwohl der Schwerpunkt dieses Artikels auf den sieben SNPs innerhalb von fünf Genen liegt, die mit Magenkrebs in Verbindung stehen, ist die Sequenzierung in der praktischen Anwendung nicht nur auf diese fünf Gene beschränkt. Diese Arbeit stellt definitiv eine signifikante Korrelation zwischen den sieben SNPs und der Sensitivität gegenüber 5-FU-Chemotherapie bei Magenkrebs her.

<a href="https://app.jove.com/t/6602">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/64016">10.3791/66058</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/66058">Multi-Gene Single Nucleotide Polymorphism Detection in Gastric Cancer Based on Ion Semiconductor Sequencing Platform</a>. The Authors section was&#160;updated.

Erratum: Multi-Gene Single Nucleotide Polymorphism Detection in Gastric Cancer Based on Ion Semiconductor Sequencing Platform

Magenkrebs ist eine schwere Belastung im Bereich der globalen öffentlichen Gesundheit. Laut der Global Cancer Statistics 2020, die von der Internationalen Agentur für Krebsforschung (IARC) veröffentlicht wurde, ist Magenkrebs die fünfthäufigste diagnostizierte Krebserkrankung und die vierthäufigste krebsbedingte Todesursache. Weltweit ist die Inzidenz der altersstandardisierten Rate in Ostasien sowohl bei Männern als auch bei Frauen am höchsten1. Das Auftreten von Magenkrebs ist schleichend, was dazu führt, dass Patienten im Frühstadium oft keine offensichtlichen und spezifischen Symptome haben. Von allen Magenkrebspatienten werden in Ländern ohne Routine-Vorsorgeuntersuchungen 80 % bis 90 % der Patienten entweder in einem fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert, in dem der Tumor nicht operiert werden kann, oder es kommt innerhalb von 5 Jahren nach der Operation zu einem Rückfall2.
Bei fortgeschrittenem oder metastasiertem Magenkrebs ist die Chemotherapie die Hauptbehandlung, die die Überlebensrate und die Lebensqualität der Patienten verbessern kann. Für die Ersttherapie von Patienten mit metastasiertem Magenkrebs ist eine Platin-Fluoropyrimidin-Therapie die erste Wahl für ein Erstlinien-Chemotherapeutikum3. Fluoropyrimidin umfasst hauptsächlich 5-Fluorouracil (5-FU) und orale Fluoropyrimidinderivate wie Capecitabin und Tegafur. Das Hauptziel von 5-FU sind Enzyme, die mit dem Folatstoffwechsel in Verbindung stehen, die die DNA-Synthese hemmen und das Wachstum von Tumorgewebe verlangsamen. Unerwünschte Arzneimittelwirkungen schränken ihren Nutzen ein, wobei Durchfall, Mukositis, Myelosuppression und Hand-Fuß-Syndrom zu den häufigsten Nebenwirkungen gehören. Es wurde berichtet, dass das therapeutische Ansprechen und unerwünschte Arzneimittelwirkungen eng mit Faktoren im Folatstoffwechselweg zusammenhängen. Bemerkenswert ist, dass die homozygote Mutation von rs1801131 als Indikator für das Hand-Fuß-Syndrom identifiziert wurde (p = 4,1 x 10-6, OR = 9,99, 95% CI: 3,84-27,8)4. Obwohl Fluoropyrimidine in großem Umfang in der Chemotherapie gegen Krebs eingesetzt werden, ist ihre Chemoresistenz ein häufiger Notfall, der zu einem therapeutischen Versagen bei der Behandlung von Magenkrebs führt. Zum Beispiel beträgt die Gesamtansprechrate nur 10%-15% bei Patienten mit fortgeschrittenem Darmkrebs, die mit nur 5-FU behandeltwerden. Außerdem haben Fluoropyrimidine eine Toxizität, die nicht ignoriert werden kann. Zu den durch 5-FU induzierten Toxizitätsreaktionen gehören hauptsächlich Durchfall, Hand-Fuß-Syndrom, Stomatitis, Neutropenie, Thrombozytopenie, Neurotoxizität und sogar der Tod6. Eine schwere behandlungsbedingte Toxizität tritt bei 10 % bis 30 % der mit Fluoropyrimidinen behandelten Patienten auf, und eine tödliche Toxizität tritt bei 0,5 % bis 1 % dieser Patienten auf7.
Eine Studie zur Lebensqualität von Patienten mit fortgeschrittenem Magenkrebs ergab, dass die Ansprechrate bei Patienten, die eine 5-FU-basierte Chemotherapie erhielten, weniger als 50 % betrug8. Daher ist das Verständnis der Faktoren, die mit der Sensitivität einer 5-FU-basierten Chemotherapie zusammenhängen, besonders wichtig für eine präzise Behandlung, um die Ansprechrate und Wirksamkeit zu maximieren und gleichzeitig die Toxizität zu minimieren. In Anbetracht der Tatsache, dass 5-FU eng mit dem Folatstoffwechsel zusammenhängt, könnten die genetischen Varianten von Enzymen im Folatstoffwechselweg einer der Faktoren sein. Etwa 90 % der Variation der menschlichen Sequenz wird auf Einzelbasenmutationen in der DNA zurückgeführt, die als Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) bekannt sind9. Wenn SNPs die Enzymeigenschaften des Folatstoffwechsels verändern, kann dies bei Magenkrebspatienten zu individuellen Unterschieden in der Wirksamkeit, Toxizität und Chemoresistenz gegenüber Fluorouracil führen.
Die Methylentetrahydrofolatreduktase (MTHFR) wird hauptsächlich zur Umwandlung von 5,10-Methylentetrahydrofolat (5,10-MTHF) in 5-Methyltetrahydrofolat verwendet. 5-FdUMP, ein Metabolit von 5-FU, bildet inaktive ternäre mit 5,10-MTHF und Thymidylatsynthase (TS), was die Aktivität von TS hemmt und zu einem Mangel an dTMP10 führt. Die Akkumulation von 5,10-MTHF kann die Hemmwirkung von 5-FU auf TS verstärken, die mit der Aktivität von MTHFR korreliert. MTHFR rs1801131 und rs1801133 sind die häufigsten Polymorphismen, die mit einer geringeren Enzymaktivität (eine Abnahme von 75% für rs1801133 und 30% für rs181131) und einer Akkumulation von 5,10-MTHF11 zusammenhängen.
Die Dihydrofolatreduktase (DHFR) ist das Schlüsselenzym im Folatstoffwechsel und in der DNA-Synthese. DHFR reduziert Dihydrofolat unter Verwendung von NADPH zu Tetrahydrofolat (THF), das zum Transport einer Kohlenstoffeinheit verwendet wird. SNPs von DHFR können seine Expression beeinflussen, die Aktivität und Häufigkeit von THF verändern und den Folatstoffwechsel und die Empfindlichkeit von 5-FU weiter beeinflussen. Die Punktmutation DHFR rs1650697 tritt im Hauptpromotor des DHFR-Gens auf, wodurch die DHFR-Expression erhöhtwird 12. Eine Studie ergab, dass rs442767 mit der Wirksamkeit und Toxizität von Antifolat-Antitumormedikamenten wie Pemetrexed und Methotrexat verbunden ist. In Bezug auf den SNP rs442767 bedeutet ein GT-Genotyp die Vererbung eines G-Allels und eines T-Allels am selben Ort auf den homologen Chromosomen von jedem Elternteil. In ähnlicher Weise bezeichnen die Genotypen GG und TT die Vererbung von entweder zwei G-Allelen bzw. zwei T-Allelen. Im Vergleich zum Genotyp GT+TT ist GG mit einem verringerten ereignisfreien Überleben und einem erhöhten Risiko verbunden13. Dies deutet darauf hin, dass rs442767 zu einem gewissen potenziellen Einfluss auf 5-FU führen könnte.
Die Methioninsynthase (MTR) katalysiert die Remethylierung von Homocystein zu Methionin, das eine wichtige Rolle im Folatstoffwechsel spielt. MTR rs1805087 ist der häufigste Polymorphismus des MTR-Gens . MTR rs1805087 ersetzt Asparaginsäure durch Glycin an der potenziell funktionellen Stelle des Proteins, was die Aktivität von MTR verringern kann. Probanden mit dem G-Allel hatten einen erhöhten Plasma-Folat-Spiegel und einen verringerten Plasma-Homocystein-Spiegelvon 14. Im Gegenteil, eine Studie zeigte, dass rs1805087 keinen statistisch signifikanten Zusammenhang mit der Wirksamkeit von 5-FU hat. Aber diese Studie konzentrierte sich auf Darmkrebs und die Stichprobengröße war klein. Der Zusammenhang zwischen rs1805087 und der Wirksamkeit von 5-FU bei Magenkrebspatienten muss noch erforscht werden15.
Die Gamma-Glutamylhydrolase (GGH) ist ein lysosomales Enzym, das die intrazellulären Folatkonzentrationen reguliert. Pteroylglutaminsäure ist das Synonym für Folsäure, die sich aus Pterin, p-Aminomethylbenzoesäure und Glutaminsäure zusammensetzt. Es gibt zwei Formen von Folsäure in Organismen, Monoglutamatfolat und polyglutamiertes Folat. THF-Polyglutamat wird von GGH enzymatisch in monoglutaminisches Folat umgewandelt, wobei nacheinander entweder Monoglutamat (Mono-Glu) oder Di-Glutamat (di-Glu) freigesetzt wird16. Eine Studie über die GGH-Expression bei Patienten mit lokal fortgeschrittenem Magenkrebs zeigte, dass eine hohe GGH-Expression 5,10-MTHF und TS reduzieren kann, was bedeutet, dass nur eine geringe Dosierung von 5-FU erforderlich ist, um die TS-hemmende Wirkung bei diesen Patienten zu erzielen17. GG ist ein prognostischer Biomarker bei Patienten mit lokal fortgeschrittenem Magenkrebs, die mit einer postoperativen adjuvanten Chemotherapie mit S-1, einem Prodrug von 5-FU, behandelt werden, und spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der intrazellulären Homöostase von Folsäure18. GGH rs11545078 ist eine Missense-Variante und ändert Thr-127 in Ile-127. Eine Studie, die sich auf die Substratspezifität von GGH konzentriert, deutet darauf hin, dass rs11545078 im Vergleich zum Wildtyp zu einem höheren Km und einer geringeren katalytischen Effizienz für Methotrexat führt und die Struktur ähnlich wie bei Folsäure19 ist. Insgesamt ist die Erforschung des Zusammenhangs zwischen rs11545078 und den klinischen Ergebnissen von 5-FU eine vielversprechende Strategie, um die Arzneimittelresistenz zu verstehen.
Die gelöste Trägerfamilie 19 Mitglied 1 (SLC19A1), auch reduzierter Folattransporter genannt, ist ein typisches fazilitatives Transmembranprotein, das reduzierte Folate importiert, die Säugetierzellen nicht in der Lage sind, de novo zu synthetisieren, was bekanntermaßen die Reaktion des Tumors auf 5-FU20 abschätzt. Es wurden jedoch nur wenige Studien zur Assoziation zwischen 5-FU und SLC19A1 Polymorphismus durchgeführt21. Bei Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, die Pemetrexed, ein Folatanalogon, erhielten, trug das rs1051298 auf dem SLC19A1-Gen dazu bei, das Risiko für alle unerwünschten Arzneimittelwirkungen zu erhöhen und das Gesamtüberleben zu verringern22,23. SLC19A1 rs1051298, eine 3'-untranslatierte Regionsvariante über den Folatstoffwechsel, könnte helfen, einige der individuellen Unterschiede bei der 5-FU-Therapie zu erklären. Hier geht es darum, den Zusammenhang zwischen rs1051298 und 5-FU-Resistenz bei Patienten mit Magenkrebs zu evaluieren.
Für den qualitativen Gennachweis in vitro wird ein auf Halbleitersequenzierung basierendes Kit verwendet (Abbildung 1), das 7 ausgewählte SNPs in 5 Genen nachweisen kann, die Mutationen rs1801131 und rs1801133 des MTHFR-Gens , die Mutationen rs1650697 und rs442767 des DHFR-Gens , die rs1805087 Mutation des MTR-Gens , die rs11545078 Mutation des GGH-Gens und rs1051298 des SLC19A1 Gen in Tumorgewebeproben von Magenkrebspatienten. Zunächst wurde die Nukleinsäure der Probe extrahiert und das Zielfragment mittels PCR spezifisch amplifiziert. An beiden Enden des DNA-Fragments wurde ein universeller Sequenzierungsadapter angebracht, um eine Bibliothek zu erstellen, die für die Sequenzierung verwendet werden kann. Anschließend wurde die Amplifikation der Sequenzierungsbibliothek durch PCR durchgeführt, um ein Sequenzierungstemplate zu bilden. Das positive Template wurde angereichert, um die Anforderungen an die Sequenzierung zu erfüllen. Verwendung des Halbleitersequenzierungssystems, indem der DNA-Strang in dem winzigen Loch des Halbleiterchips fixiert wird. Die DNA-Polymerase nimmt die einzelsträngige DNA als Matrize und synthetisiert den komplementären DNA-Strang nach dem Prinzip der komplementären Basenpaarung. Jedes Mal, wenn eine Base in einer DNA-Kette verlängert wird, wird ein Proton freigesetzt, was zu lokalen pH-Änderungen führt. Ein ionischer Sensor erkennt pH-Änderungen und wandelt chemische Signale in digitale Signale um, so dass Basen in Echtzeit interpretiert und schließlich die Basensequenz jedes DNA-Abschnitts erhalten werden kann. Bioinformatische Analysen wurden verwendet, um diese Sequenzen mit der Referenzkarte des menschlichen Genoms abzugleichen. Wenn Gene im Zusammenhang mit Magenkrebs mutieren, verändern sich die entsprechenden DNA-Basensequenzen, um die Mutationsinformationen verwandter Gene zu erhalten.
Das Ergebnis kann den Genmutationsstatus anzeigen und Ärzten als Referenz dienen, um geeignete Arten und Dosierungen von Chemotherapeutika auszuwählen und die Arzneimittelresistenz bei Magenkrebspatienten vorherzusagen. Die Testergebnisse dienen jedoch nur als klinische Referenz und werden nicht als einzige Grundlage für eine individualisierte Behandlung von Patienten empfohlen. Ärzte sollten ein umfassendes Urteil auf der Grundlage des Zustands des Patienten, der Arzneimittelindikationen, der Behandlungsreaktionen und anderer Labortestindikatoren fällen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL DNA LoBind Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplification primer of gastric cancer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>The primers are sythesized by Thermo Fshier according to the sequence in Table 1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deparaffinization</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA purification magnetic beads</td>
			<td>Bechkman</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent 
			Factory Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>http://www.chemicalreagent.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion AmpliSeq Library Kit 2.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4480441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02D-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02D-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips&#160;</td>
			<td>Quality Scientific Products</td>
			<td></td>
			<td>https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink RNA Mini Columns</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A29839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop mini centrifuge</td>
			<td>SCILOGES</td>
			<td>S1010E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicro nucleic acid analyzer</td>
			<td>BEIJING ORIENTAL SCIENCE &#38; TECHNOLOGY DEVELOPMENT LTD.</td>
			<td>BD-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-gene single nucleotide polymorphism detection in gastric cancer based on ion semiconductor sequencing platform

Magenkrebs ist ein häufiger heterogener Tumor. Die meisten Patienten haben zum Zeitpunkt der Diagnose Magenkrebs im fortgeschrittenen Stadium und benötigen oft eine Chemotherapie. Obwohl 5-Fluorouracil (5-FU) in großem Umfang zur Behandlung eingesetzt wird, müssen seine therapeutische Sensitivität und Arzneimittelverträglichkeit noch bestimmt werden, was die Bedeutung einer individualisierten Verabreichung unterstreicht. Die Pharmakogenetik kann die klinische Umsetzung einer individualisierten Behandlung leiten. Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) tragen als genetischer Marker zur Auswahl geeigneter Chemotherapien und Dosierungen bei. Einige SNPs sind mit dem Folatstoffwechsel assoziiert, dem therapeutischen Ziel von 5-FU. Die Methylentetrahydrofolatreduktase (MTHFR) rs1801131 und rs1801133, die Dihydrofolatreduktase (DHFR) rs1650697 und rs442767, die Methioninsynthase (MTR) rs1805087, die Gamma-Glutamylhydrolase (GGH) rs11545078 und die Solute Carrier Family 19 Member 1 (SLC19A1) rs1051298 wurden bei verschiedenen Krebsarten und Antifolat-Antitumormedikamenten untersucht, die eine potenzielle Vorhersage und leitende Bedeutung für Anwendung von 5-FU. Die Ionenstrom-Halbleiter-Sequenzierungstechnologie der nächsten Generation kann SNPs, die mit Magenkrebs in Verbindung stehen, schnell erkennen. Jedes Mal, wenn eine Base in einer DNA-Kette verlängert wird, wird ein H+ freigesetzt, was zu lokalen pH-Änderungen führt. Der ionische Sensor erkennt pH-Änderungen und wandelt chemische Signale in digitale Signale um, wodurch eine Sequenzierung durch Synthese erreicht wird. Diese Technik hat einen geringen Probenbedarf, eine einfache Bedienung, niedrige Kosten und eine schnelle Sequenzierungsgeschwindigkeit, was für die Steuerung der individualisierten Chemotherapie durch SNPs von Vorteil ist.

Gastric cancer is a heavy burden in the field of global public health. According to the Global Cancer Statistics 2020, published by the International Agency for Research on Cancer (IARC), gastric cancer is the fifth most diagnosed cancer and the fourth leading cause of cancer-related death. Worldwide, the incidence of age-standardized rate in East Asia is the highest in both males and females1. The occurrence of gastric cancer is insidious, which means that patients often do not have any obvious and specific symptoms in the early stage. Among all gastric cancer patients, in countries without routine screening, 80%-90% of patients are either diagnosed at an advanced stage when the tumor cannot be operated on or relapses within 5 years after the operation2.
For advanced or metastatic gastric cancer, chemotherapy is the main treatment, which can improve the survival rate and quality of life of patients. For the initial therapy of patients with metastatic gastric cancer, a platinum-fluoropyrimidine regimen is the principal choice for a first-line chemotherapeutic regimen3. Fluoropyrimidine mainly includes 5-fluorouracil (5-FU) and oral fluoropyrimidine derivatives, such as capecitabine and tegafur. The main target of 5-FU is folate metabolism-related enzymes, which inhibit DNA synthesis and slow the growth of tumor tissue. Adverse drug reactions limit their utility, with diarrhea, mucositis, myelosuppression, and hand-foot syndrome among the most frequent side effects. It has been reported that therapeutic response and adverse drug reactions are closely related to factors in the folate metabolic pathway. Notably, the homozygous mutation of rs1801131 has been identified as an indicator for hand-foot syndrome (p = 4.1 x 10-6, OR =9.99, 95% CI: 3.84-27.8)4. Although fluoropyrimidines are extensively used in anticancer chemotherapy, their chemoresistance is a common emergency, causing therapeutic failure in gastric cancer treatment. For instance, the overall response rate is only 10%-15% among patients with advanced colorectal cancer treated with 5-FU only5. Also, fluoropyrimidines have toxicity that cannot be ignored. The toxicity reactions induced by 5-FU mainly include diarrhea, hand-foot syndrome, stomatitis, neutropenia, thrombocytopenia, neurotoxicity, and even death6. Severe treatment-related toxicity occurs in 10%-30% of patients treated with fluoropyrimidines, and fatal toxicity occurs in 0.5%-1% of these patients7.
A quality-of-life study of patients with advanced gastric cancer found that the response rate was less than 50% for those who received 5-FU-based chemotherapy8. Therefore, understanding the factors related to the sensitivity of 5-FU-based chemotherapy is particularly important for precise treatment to maximize the response rate and effectiveness while minimizing toxicity. Considering that 5-FU is closely related to folate metabolism, the genetic variants of enzymes in folate metabolic pathway may be one of the factors. About 90% of human sequence variation is attributed to single base mutations in DNA, known as single nucleotide polymorphisms (SNPs)9. When SNPs change the enzyme properties of folate metabolism, it may lead to individual differences in efficacy, toxicity and chemoresistance to fluorouracil in gastric cancer patients.
Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) is mainly used to convert 5,10-methylenetetrahydrofolate (5,10-MTHF) into 5-methyltetrahydrofolate. 5-FdUMP,a metabolite of 5-FU, forms inactive ternary with 5,10-MTHF and thymidylate synthase (TS), inhibiting activity of TS and leading to deficiency of dTMP10. Accumulation of 5,10-MTHF can enhance the inhibition effect of 5-FU on TS, which is correlated with the activity of MTHFR. MTHFR rs1801131 and rs1801133 are the most common polymorphisms, which are related to lower enzyme activity (a decrease of 75% for rs1801133 and 30% for rs181131) and accumulation of 5,10-MTHF11.
Dihydrofolate reductase (DHFR) is the key enzyme in folate metabolism and DNA synthesis. DHFR reduces dihydrofolate, using NADPH, to tetrahydrofolate (THF) which is used to carry one-carbon unit. SNPs of DHFR may affect its expression, change the activity and abundance of THF, and further affect folate metabolism and sensitivity of 5-FU. DHFR rs1650697 point mutation occurs in the major promoter of DHFR gene, which increases the DHFR expression12. A study found that rs442767 is associated with the efficacy and toxicity of antifolate antitumor drugs, such as pemetrexed and methotrexate. Regarding the SNP rs442767, a GT genotype signifies the inheritance of a G allele and a T allele at the same locus on the homologous chromosomes from each parent. Similarly, the genotypes GG and TT denote the inheritance of either two G alleles or two T alleles, correspondingly. Compared with genotype GT+TT, GG is related to decreased event-free survival and increased risk13. This suggests that rs442767 may lead to certain potential influence on 5-FU.
Methionine synthase (MTR) catalyzes the re-methylation of homocysteine to methionine, which plays an important role in folate metabolism. MTR rs1805087 is the most common polymorphism of MTR gene. MTR rs1805087 substitutes glycine for aspartic acid at the potentially functional site of protein, which may decrease the activity of MTR. Subjects with the G allele had increased plasma folate level and decreased plasma homocysteine level14. On the contrary, a study showed that rs1805087 has no statistically significant association with the efficacy of 5-FU. But this study focused on colorectal cancer and the sample size was small. The relationship between rs1805087 and the efficacy of 5-FU in gastric cancer patients remains to be explored15.
Gamma-glutamyl hydrolase (GGH) is a lysosomal enzyme that regulates intracellular folate concentrations. Pteroylglutamic acid is the synonym of folic acid that is made up of pterin, p-aminomethylbenzoic acid and glutamic acid. There are two forms of folic acid in organisms, monoglutamate folate and polyglutamated folate. THF-polyglutamate is enzymatically converted to monoglutamic folate by GGH, successively releasing either mono-Glutamate (mono-Glu) or di-Glutamate (di-Glu)16. A study about GGH expression in patients with locally advanced gastric cancer, showed high GGH expression could reduce 5,10-MTHF and TS, which means that only a small dosage of 5-FU is needed to achieve the TS inhibitory effect in these patients17. GG is a prognostic biomarker in patients with locally advanced gastric cancer treated with postoperative adjuvant chemotherapy with S-1, a prodrug of 5-FU, and plays an important role in maintaining intracellular homeostasis of folic acid18. GGH rs11545078 is missense variant and alters Thr-127 to Ile-127. A study focusing on substrate specificity of GGH suggests that rs11545078, compared to wild-type, results in higher Km and lower catalytic efficiency for methotrexate and the structure is similar to folic acid19. Together, exploring the relationship between rs11545078 and clinical outcomes of 5-FU is a promising strategy to understand drug resistance.
Solute carrier family 19 member 1 (SLC19A1), also named reduced folate transporter, is a typical facilitative transmembrane protein that imports reduced folates that mammalian cells lack the ability to de novo synthesize, which is recognized to estimate the response of tumor to 5-FU20. However, only a few studies have been performed regarding the association between 5-FU and SLC19A1 polymorphism21. In patients with non-small cell lung cancer receiving pemetrexed which is a folate analog, the rs1051298 on the SLC19A1 gene contributed to increase the risk of all adverse drug reaction and decrease overall survival22,23. SLC19A1 rs1051298, a 3&#39;untranslated region variant about folate metabolism, may help explain some of the individual differences about 5-FU therapy. Here the aim is to evaluate the association between rs1051298 and 5-FU resistance among patients with gastric cancer.
A kit, based on semiconductor sequencing, is used for qualitative gene detection in vitro (Figure 1), which can detect 7 selected SNPs in 5 genes, the rs1801131 and rs1801133 mutations of MTHFR gene, rs1650697 and rs442767 mutations of DHFR gene, rs1805087 mutation of MTR gene, rs11545078 mutation of GGH gene and rs1051298 of SLC19A1 gene in tumor tissue samples of gastric cancer patients. Firstly, the sample nucleic acid was extracted, and the target fragment was specifically amplified by PCR. A universal sequencing adapter was added at both ends of the DNA fragment to construct a library that can be used for sequencing. Then amplification of the sequencing library by PCR to form a sequencing template was done. The positive template was enriched to meet the sequencing requirements. Using the semiconductor sequencing system, by fixing the DNA strand in the tiny hole of the semiconductor chip. DNA polymerase takes the single-stranded DNA as the template and synthesizes the complementary DNA strand according to the principle of complementary base pairing. Each time a base is extended in a DNA chain, a proton will be released, causing local pH changes. An ionic sensor detects pH changes and converts chemical signals into digital signals, so that bases can be interpreted in real time, and finally the base sequence of each DNA segment can be obtained. Bioinformatics analysis was used to match these sequences to the reference map of the human genome. When gastric cancer related genes mutate, their corresponding DNA base sequences will change, so as to obtain the mutation information of related genes.
The result can display gene mutation status and provide reference for clinicians to select appropriate types and dosages of chemotherapy drugs and predict the drug resistance for gastric cancer patients. However, the test results are only for clinical reference and are not recommended to be the only basis for individualized treatment of patients. Clinicians should make a comprehensive judgment based on the patient&#39;s condition, drug indications, treatment reactions and other laboratory test indicators.

Autor im Rampenlicht: Genetisches Profiling für die Fluorouracil-Reaktion bei Magenkrebs

Nachweis von Multi-Gen-Einzelnukleotid-Polymorphismen bei Magenkrebs basierend auf einer Ionen-Halbleiter-Sequenzierungsplattform

Die Ermittlung der Testergebnisse beruht auf dem positiven Beurteilungswert, der auch als Referenzintervall anerkannt wird. Verwenden Sie die Halbleiter-Sequenzierungsmethode, um die gesammelten klinischen Proben zu erkennen. Wenn der Mutationshäufigkeitswert der Gene MTHFR, DHFR, MTR, GGH und SLC19A1 ≥ 5% beträgt, ist das Nachweisergebnis die Mutante des entsprechenden Gens. Wenn der Wert der Mutationshäufigkeit < 5 % beträgt, ist das Nachweisergebnis der Wildtyp des entsprechenden Gens26.
Anhand der folgenden Kriterien kann festgestellt werden, ob die Erkennungsergebnisse glaubwürdig sind. Erstens, wenn die durchschnittliche Abdeckung der DNA-Sequenzierungsergebnisse ≥ 500 beträgt und die kartierten Lesevorgänge der RNA-Sequenzierungsergebnisse ≥ 20000 liegen, sind die Testergebnisse glaubwürdig27. Andernfalls wird empfohlen, den Test erneut durchzuführen. Zweitens beträgt die durchschnittliche Abdeckung der positiven DNA-Qualitätskontrolle von Magenkrebs ≥ 500, und das Testergebnis sollte mit den Mutationen rs1801131 und rs1801133 des MTHFR-Gens , den Mutationen rs1650697 und rs442767 des DHFR-Gens , der rs1805087-Mutation des MTR-Gens , der rs11545078-Mutation des GGH-Gens und der rs1051298-Mutation des SLC19A1 übereinstimmen Gen als positiv. Andernfalls wird empfohlen, den Test erneut durchzuführen. Drittens beträgt die durchschnittliche Abdeckung der negativen DNA-Qualitätskontrolle von Magenkrebs ≥ 500, und die Nachweisergebnisse sollten zeigen, dass es sich bei allen Stellen innerhalb des Nachweisbereichs dieses Kits um Wildtyp-Stellen handelt. Andernfalls wird empfohlen, den Test erneut durchzuführen. Schließlich liegt die Bibliothekskonzentration unter 0,2 ng/μl, was auf den Abbau von DNA oder RNA in der Probe oder auf das Versäumnis zurückzuführen sein kann, den experimentellen Prozess strikt zu befolgen oder abgelaufene Reagenzien während des Experiments zu verwenden. Die oben genannten Bedingungen können dazu führen, dass die Sequenzierungsqualität abnimmt oder fehlschlägt. Es wird empfohlen, die Bibliothek neu zu erstellen.
Mit diesem Kit werden eine Reihe von Schritten befolgt, um eine Sequenzierungsbibliothek aus klinischen Proben aufzubauen. Die Bibliothek wird dann auf einer Ionenhalbleiter-Sequenzierungsplattform sequenziert, wobei ANNOVAR für die Annotation der Ergebnisse verwendet wird. Nach der Sequenzierung wird ein Dokument verwendet, um die Mutantentypen für jede Probe zusammenzufassen. Das Fehlen eines mutierten Typs deutete darauf hin, dass die Probe diese spezifische Mutation nicht aufwies. Die ergänzendeTabelle 3 ist ein typisches Beispiel dafür. Tabelle 12 enthält grundlegende Informationen über die hier nachgewiesenen SNPs. Analyse jedes SNPs mit filterbasierter Annotation in verschiedenen Datenbanken, wie z. B. 1000 Genomes Project (1000g2015aug; https://www.internationalgenome.org/; Tabelle 13) und das Exome Aggregation Consortium (ExAC; https://gnomad.broadinstitute.org/; Tabelle 14) kann zeigen, dass unterschiedliche SNPs in verschiedenen Populationen signifikant vorhanden sind.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66058/66058fig01.jpg"> Abbildung 1: Flussdiagramm für das Protokoll. Flussdiagramm des Multigennachweises für Magenkrebs mit Hilfe der Halbleiter-Sequenzierungsmethode. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66058/66058fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Chromosom</td>
			<td>Ort</td>
			<td colspan="2">Intervall für das Primer-Design</td>
			<td>Linke Grundierung</td>
			<td>Richtige Grundierung</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">chr1</td>
			<td>11854475</td>
			<td colspan="2">chr1:11854175-11854775</td>
			<td>ACAGGATGGG GAAGTCACAG</td>
			<td>AAACCGGAAT GGTCACAAAG</td>
		</tr><tr><td>11856377</td>
			<td colspan="2">Chr1:11856077-11856677</td>
			<td>CTTCAGGTCA GCCTCAAAGC</td>
			<td>TCCCTGTGGT CTCTTCATCC</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Chr5</td>
			<td>79950780</td>
			<td colspan="2">chr5:79950480-79951080</td>
			<td>CGCCGCACAT AGTAGGTTCT</td>
			<td>CTTCCTCCTC CAGCCCTATC</td>
		</tr><tr><td>79951495</td>
			<td colspan="2">chr5:79951195-79951795</td>
			<td>CTTGGGTCAC CTGCACAGTA</td>
			<td>ATTTTGAAGC ACCCAAGCTG</td>
		</tr><tr><td>chr1</td>
			<td>237048499</td>
			<td colspan="2">chr1:237048199-237048799</td>
			<td>GTCAAAGGCC AGTCCCTTCT</td>
			<td>CTCCCTTCAC CAACTGTGCT</td>
		</tr><tr><td>Chr8</td>
			<td>63938763</td>
			<td colspan="2">chr8:63938463-63939063</td>
			<td>CAGTGAAGTT CAGCGGCAT</td>
			<td>TATTTTCCTGT GTGGGGCAC</td>
		</tr><tr><td>Chr21</td>
			<td>46934825</td>
			<td colspan="2">Chr21:46934525-46935125</td>
			<td>CCAACCTGAG ATGGCTTTTC</td>
			<td>TCCTTGGTGC TCTTGCTTTT</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Primer, die für die sieben ausgewählten SNPs in fünf Genen verwendet wurden. Dieses Blatt enthält Informationen über die Position der Primer von SNPs, die mit einer 5-FU-Resistenz bei Magenkrebs assoziiert sind.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Temperatur</td>
			<td>Zeit</td>
			<td>Nein. Anzahl der Zyklen</td>
		</tr><tr><td>99 °C</td>
			<td>2 Minuten</td>
			<td>1 Zyklus</td>
		</tr><tr><td>99 °C</td>
			<td>15 Sek.</td>
			<td rowspan="2">22 Zyklen</td>
		</tr><tr><td>60 °C</td>
			<td>4 Minuten</td>
		</tr><tr><td>10 °C</td>
			<td>Halten</td>
			<td>1 Zyklus</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 2: Thermisches Zyklusprogramm für die DNA-Amplifikation. Thermische Reaktionsbedingungen wie Temperatur, Zeit und Zyklen werden angezeigt.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Schritt</td>
			<td>Temperatur</td>
			<td>Zeit</td>
			<td>Nein. Anzahl der Zyklen</td>
		</tr><tr><td>Enzyme aktivieren</td>
			<td>99 °C</td>
			<td>2 Minuten</td>
			<td>1 Zyklus</td>
		</tr><tr><td>Vergällen</td>
			<td>99 °C</td>
			<td>15 Sek.</td>
			<td>30 Zyklen</td>
		</tr><tr><td>Glühen und Verlängern</td>
			<td>60 °C</td>
			<td>4 Minuten</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Erhalten</td>
			<td>10 °C</td>
			<td>Halten</td>
			<td>1 Zyklus</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 3: Thermisches Zyklusprogramm für die cDNA-Amplifikation. Thermische Reaktionsbedingungen wie Temperatur, Zeit und Zyklen werden angezeigt.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Temperatur</td>
			<td>Zeit</td>
			<td>Nein. Anzahl der Zyklen</td>
		</tr><tr><td>50 °C</td>
			<td>10 Minuten</td>
			<td>1 Zyklus</td>
		</tr><tr><td>55 °C</td>
			<td>10 Minuten</td>
			<td>1 Zyklus</td>
		</tr><tr><td>60 °C</td>
			<td>ca. 20 Minuten</td>
			<td>1 Zyklus</td>
		</tr><tr><td>10 °C</td>
			<td>Halten</td>
			<td>1 Zyklus</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 4: Programm des thermischen Zyklus für den Aufschluss der Primersequenz. Thermische Reaktionsbedingungen wie Temperatur, Zeit und Zyklen werden angezeigt.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Bestandteil</td>
			<td>Volumen</td>
		</tr><tr><td>P1-Adapter</td>
			<td>1,5 μl</td>
		</tr><tr><td>Spezifischer Adapter X</td>
			<td>1,5 μl</td>
		</tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td>
			<td>3 μL</td>
		</tr><tr><td>Gesamtvolumen des Reaktionssystems</td>
			<td>6 μL</td>
		</tr><tr><td>X: Gibt die spezifische Adapternummer an</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 5: Reihenfolge der Zugabe von Reagenzien zur Herstellung der Adaptermischung. Geben Sie die Reagenzien in der hier angegebenen Reihenfolge in das Röhrchen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Bestandteil</td>
			<td>Volumen</td>
		</tr><tr><td>Puffer anschließen</td>
			<td>4 μL</td>
		</tr><tr><td>Adapter Mischung X</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr><tr><td>DNA-Ligase</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr><tr><td>Gesamtvolumen des Reaktionssystems</td>
			<td>30 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 6: Reihenfolge der Zugabe von Reagenzien zur Herstellung des aufgeschlossenen Primers. Geben Sie die Reagenzien in der hier angegebenen Reihenfolge in das Röhrchen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Temperatur</td>
			<td>Zeit</td>
			<td>Nein. Anzahl der Zyklen</td>
		</tr><tr><td>22 °C</td>
			<td>30 Minuten</td>
			<td>1 Zyklus</td>
		</tr><tr><td>72 °C</td>
			<td>10 Minuten</td>
			<td>1 Zyklus</td>
		</tr><tr><td>10 °C</td>
			<td>Halten</td>
			<td>1 Zyklus</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 7: Programm des thermischen Zyklus für den Anschluss des Adapters an die DNA. Thermische Reaktionsbedingungen wie Temperatur, Zeit und Zyklen werden angezeigt.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Temperatur</td>
			<td>Zeit</td>
			<td>Nein. Anzahl der Zyklen</td>
		</tr><tr><td>22 °C</td>
			<td>30 Minuten</td>
			<td>1 Zyklus</td>
		</tr><tr><td>68 °C</td>
			<td>5 Minuten</td>
			<td>1 Zyklus</td>
		</tr><tr><td>72 °C</td>
			<td>5 Minuten</td>
			<td>1 Zyklus</td>
		</tr><tr><td>10 °C</td>
			<td>Halten</td>
			<td>1 Zyklus</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 8: Programm des thermischen Zyklus für den Anschluss des Adapters an die cDNA. Thermische Reaktionsbedingungen wie Temperatur, Zeit und Zyklen werden angezeigt.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Bestandteil</td>
			<td>Volumen</td>
		</tr><tr><td>Reaktionslösung der Bibliotheksamplifikation</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr><tr><td>Mischung aus Bibliotheks-Primer</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr><tr><td>Gesamtvolumen des Reaktionssystems</td>
			<td>52 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 9: Reihenfolge der Zugabe von Amplifikationsreagenzien. Geben Sie die Reagenzien in der hier angegebenen Reihenfolge in das Röhrchen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Temperatur</td>
			<td>Zeit</td>
			<td>Nein. Anzahl der Zyklen</td>
		</tr><tr><td>98 °C</td>
			<td>2 Minuten</td>
			<td>1 Zyklus</td>
		</tr><tr><td>98 °C</td>
			<td>15 Sek.</td>
			<td rowspan="2">5 Zyklen</td>
		</tr><tr><td>60 °C</td>
			<td>1 min</td>
		</tr><tr><td>10 °C</td>
			<td>Halten</td>
			<td>1 Zyklus</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 10: Programm für den thermischen Zyklus zur Amplifikation der DNA-Bibliothek. Thermische Reaktionsbedingungen wie Temperatur, Zeit und Zyklen werden angezeigt.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Temperatur</td>
			<td>Zeit</td>
			<td>Nein. Anzahl der Zyklen</td>
		</tr><tr><td>98 °C</td>
			<td>2 Minuten</td>
			<td>1 Zyklus</td>
		</tr><tr><td>98 °C</td>
			<td>15 Sek.</td>
			<td rowspan="2">5 Zyklen</td>
		</tr><tr><td>64 °C</td>
			<td>1 min</td>
		</tr><tr><td>10 °C</td>
			<td>Halten</td>
			<td>1 Zyklus</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 11: Programm für den thermischen Zyklus zur Amplifikation der cDNA-Bibliothek. Thermische Reaktionsbedingungen wie Temperatur, Zeit und Zyklen werden angezeigt.
<table border="1" fo:font-size="8px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Nr. RS1801131</td>
			<td>Nr.: rs1801133</td>
			<td>Nr.: rs1650697</td>
			<td>Nr. RS442767</td>
			<td>Nr. RS1805087</td>
			<td>Nr.: rs11545078</td>
			<td>Nr.: rs1051298</td>
		</tr><tr><td>Schiri</td>
			<td>T</td>
			<td>G</td>
			<td>Ein</td>
			<td>G</td>
			<td>Ein</td>
			<td>G</td>
			<td>G</td>
		</tr><tr><td>Alt</td>
			<td>G</td>
			<td>Ein</td>
			<td>G</td>
			<td>T</td>
			<td>G</td>
			<td>Ein</td>
			<td>Ein</td>
		</tr><tr><td>Func.ref GeneWithVer</td>
			<td>Exonisch</td>
			<td>Exonisch</td>
			<td>UTR5 (Englisch)</td>
			<td>stromaufwärts</td>
			<td>Exonisch</td>
			<td>Exonisch</td>
			<td>UTR3 (Englisch)</td>
		</tr><tr><td>Gene.ref GeneWithVer</td>
			<td>MTHFR</td>
			<td>MTHFR</td>
			<td>DHFR</td>
			<td>DHFR</td>
			<td>MTR</td>
			<td>GGH</td>
			<td>SLC19A1</td>
		</tr><tr><td>GeneDetail .refGeneWithVer</td>
			<td>.</td>
			<td>.</td>
			<td>NG_023304.1: g.5020T>G</td>
			<td>.</td>
			<td>.</td>
			<td>.</td>
			<td>NM_001205206.1: c.*64C>T; NM_001205207.1: c.*746C>T; NM_194255.2:c. *746C>T</td>
		</tr><tr><td>ExonicFunc .refGeneWithVer</td>
			<td>nicht synonym; SNV</td>
			<td>nicht synonym; SNV</td>
			<td>.</td>
			<td>.</td>
			<td>nicht synonym; SNV</td>
			<td>nicht synonym; SNV</td>
			<td>.</td>
		</tr><tr><td>AAChange.ref GeneWithVer</td>
			<td>MTHFR:NM_00 1330358.1:exo n8:c.A1409C:p. Nr. E470A; MTHFR: NM_005957.4: exon8:c.A1286 Nr.: P.E429A</td>
			<td>MTHFR:NM_00 1330358.1:exo n5:c.C788T:p. Nr. A263V; MTHFR:N M_005957.4:e xon5:c.C665T: p.A222V</td>
			<td>.</td>
			<td>.</td>
			<td>MTR:NM_0012 91939.1:exon2 5:c.A2603G:p. Nr. D868G; MTR:N M_001291940. 1:exon25:c.A1 535G: p.D512G; MTR:NM_0002 54.2:exon26:c. A2756G:p.D91 9G</td>
			<td>GGH:NM_003878 .2:exon5:c.C452T: S.T151I</td>
			<td>Jin</td>
		</tr><tr><td>ZytoBand</td>
			<td>1p36.22</td>
			<td>1p36.22</td>
			<td>5Q14.1</td>
			<td>5Q14.1</td>
			<td>1Q43</td>
			<td>8Q12.3</td>
			<td>21Q22.3</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 12: Relevante Informationen zu den SNPs. Annotation der Proben mit ANNOVAR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2" rowspan="2"></td>
			<td colspan="2">MTHFR</td>
			<td colspan="2">DHFR</td>
			<td>MTR</td>
			<td>GGH</td>
			<td>SLC19A1</td>
		</tr><tr><td>Nr. RS1801131</td>
			<td>Nr.: rs1801133</td>
			<td>Nr.: rs1650697</td>
			<td>Nr. RS442767</td>
			<td>Nr. RS1805087</td>
			<td>Nr.: rs11545078</td>
			<td>Nr.: rs1051298</td>
		</tr><tr><td colspan="2">1000g2015aug_all</td>
			<td>0.249401</td>
			<td>0.245407</td>
			<td>0.76857</td>
			<td>0.290136</td>
			<td>0.218251</td>
			<td>0.085463</td>
			<td>0.524361</td>
		</tr><tr><td colspan="2">1000g2015aug_afr</td>
			<td>0.1513</td>
			<td>0.09</td>
			<td>0.9349</td>
			<td>0.0318</td>
			<td>0.2844</td>
			<td>0.056</td>
			<td>0.5772</td>
		</tr><tr><td colspan="2">1000g2015aug_amr</td>
			<td>0.1513</td>
			<td>0.4741</td>
			<td>0.755</td>
			<td>0.3991</td>
			<td>0.1772</td>
			<td>0.0403</td>
			<td>0.4323</td>
		</tr><tr><td colspan="2">1000g2015aug_eas</td>
			<td>0.2192</td>
			<td>0.2956</td>
			<td>0.6607</td>
			<td>0.5853</td>
			<td>0.1052</td>
			<td>0.0873</td>
			<td>0.5635</td>
		</tr><tr><td colspan="2">1000g2015aug_eur</td>
			<td>0.3131</td>
			<td>0.3648</td>
			<td>0.7555</td>
			<td>0.3191</td>
			<td>0.173</td>
			<td>0.0924</td>
			<td>0.4493</td>
		</tr><tr><td colspan="2">1000g2015aug_sas</td>
			<td>0.4172</td>
			<td>0.1186</td>
			<td>0.6779</td>
			<td>0.228</td>
			<td>0.3211</td>
			<td>0.1483</td>
			<td>0.5552</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 13: Filterbasierte Annotation von SNPs im 1000 Genomes Project.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"></td>
			<td colspan="2">MTHFR</td>
			<td colspan="2">DHFR</td>
			<td>MTR</td>
			<td>GGH</td>
			<td>SLC19A1</td>
		</tr><tr><td>Nr. RS1801131</td>
			<td>Nr.: rs1801133</td>
			<td>Nr.: rs1650697</td>
			<td>Nr. RS442767</td>
			<td>Nr. RS1805087</td>
			<td>Nr.: rs11545078</td>
			<td>Nr.: rs1051298</td>
		</tr><tr><td>ExAC_ALL</td>
			<td>0.295</td>
			<td>0.3037</td>
			<td>.</td>
			<td>.</td>
			<td>0.2091</td>
			<td>0.0936</td>
			<td>.</td>
		</tr><tr><td>ExAC_AFR</td>
			<td>0.1588</td>
			<td>0.1124</td>
			<td>.</td>
			<td>.</td>
			<td>0.2666</td>
			<td>0.0545</td>
			<td>.</td>
		</tr><tr><td>ExAC_AMR</td>
			<td>0.1555</td>
			<td>0.5141</td>
			<td>.</td>
			<td>.</td>
			<td>0.1864</td>
			<td>0.0361</td>
			<td>.</td>
		</tr><tr><td>ExAC_EAS</td>
			<td>0.2148</td>
			<td>0.3052</td>
			<td>.</td>
			<td>.</td>
			<td>0.1132</td>
			<td>0.0824</td>
			<td>.</td>
		</tr><tr><td>ExAC_FIN</td>
			<td>0.3128</td>
			<td>0.2227</td>
			<td>.</td>
			<td>.</td>
			<td>0.1892</td>
			<td>0.0581</td>
			<td>.</td>
		</tr><tr><td>ExAC_NFE</td>
			<td>0.3191</td>
			<td>0.345</td>
			<td>.</td>
			<td>.</td>
			<td>0.1919</td>
			<td>0.0969</td>
			<td>.</td>
		</tr><tr><td>ExAC_OTH</td>
			<td>0.304</td>
			<td>0.3062</td>
			<td>.</td>
			<td>.</td>
			<td>0.2108</td>
			<td>0.0973</td>
			<td>.</td>
		</tr><tr><td>ExAC_SAS</td>
			<td>0.4153</td>
			<td>0.1409</td>
			<td>.</td>
			<td>.</td>
			<td>0.316</td>
			<td>0.165</td>
			<td>.</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 14: Filterbasierte Annotation von SNPs im Exome Aggregation Consortium.
Ergänzende Tabelle 1: Reihenfolge der Zugabe von Reagenzien für die DNA-Amplifikation. Geben Sie die Reagenzien in der hier angegebenen Reihenfolge in das Röhrchen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66058/Supplementary%20Table1_RE.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle 2: Sequenz der Zugabe von Reagenzien für die cDNA-Amplifikation. Geben Sie die Reagenzien in der hier angegebenen Reihenfolge in das Röhrchen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66058/Supplementary%20Table2_RE.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle 3: Beispiel für Ergebnisse der klinischen Probensequenzierung. Nur Mutationen, die in den Proben vorhanden sind, werden in den Dokumenten festgehalten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66058/Supplementary%20Table3_RE.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Genetic Profiling for Fluorouracil Response in Gastric Cancer at JoVE.com

Dieses Protokoll schlägt ganzheitliche Laborverfahren vor, die zum Nachweis von Einzelnukleotid-Polymorphismen in Magenkrebsproben auf der Grundlage einer Ionen-Halbleiter-Sequenzierungsplattform erforderlich sind. Die Zielsequenzen, Ligationsadapter, Bibliotheksamplifikation und -reinigung sowie die Kriterien für die Qualitätskontrolle werden ebenfalls detailliert beschrieben.

Gastric cancer is a common heterogeneous tumor. Most patients have advanced gastric cancer at the time of diagnosis and often need chemotherapy. Although ...

Unser Forschungsteam befasst sich mit den Elementen, die die Empfindlichkeit und Resistenz gegenüber 5-Fluorouracil, einem wichtigen Chemotherapeutikum bei Magenkrebs, bestimmen, wobei der Schwerpunkt auf genetischen Schlussfolgerungen liegt. Wir widmen uns der Aufdeckung, wie sich genetische Unterschiede auf Arzneimittelreaktionen auswirken, und der Bewertung der Machbarkeit einer Anpassung der Behandlung an individuelle genetische Profile. Dieses Protokoll ist auf den Nachweis von Einzelnukleotid-Polymorphismen bei Patienten mit Magenkrebs zugeschnitten und klärt die Korrelation zwischen genetischen Mutationen und ihrer Empfindlichkeit gegenüber Fluorouracil-Chemotherapie auf.Dieser Durchbruch ermöglicht die Vorhersage des Ansprechens von Patienten auf Fluorouracil und erleichtert die Anpassung von Behandlungsstrategien. Dieses Protokoll zeichnet sich durch eine hohe Empfindlichkeit für verschiedene Probentypen, einschließlich Blut, aus und reduziert so die Invasivität bei mehreren Proben. Die Verwendung von Halbleitersequenzierung vereinfacht den Betrieb und damit die Zeit, indem Ionenänderungen durch Passieren von Fluorourazilen direkt erkannt werden.

multi-gene-single-nucleotide-polymorphism-detection-gastric-cancer

Research

JoVE Journal

Medicine

Multi-Gene Single Nucleotide Polymorphism Detection in Gastric Cancer Based on Ion Semiconductor Sequencing Platform

383 Aufrufe.  Nanfang Hospital, Southern Medical University. Unser Forschungsteam befasst sich mit den Elementen, die die Empfindlichkeit und Resistenz gegenüber 5-Fluorouracil, einem wichtigen Chemotherapeutikum bei Magenkrebs, bestimmen, wobei der Schwerpunkt auf genetischen Schlussfolgerungen liegt. Wir widmen uns der Aufdeckung, wie sich genetische Unterschiede auf Arzneimittelreaktionen auswirken, und der Bewertung der Machbarkeit einer Anpassung der Behandlung an individuelle genetische Profile. Dieses Protokoll ist auf den Nachweis von Einzelnu...

Serie: Autor im Rampenlicht: Genetisches Profiling für die Fluorouracil-Reaktion bei Magenkrebs

Gastric cancer is a common heterogeneous tumor. Most patients have advanced gastric cancer at the time of diagnosis and often need chemotherapy. Although 5-fluorouracil (5-FU) is widely used for treatment, its therapeutic sensitivity and drug tolerance still need to be determined, which emphasizes the importance of individualized administration. Pharmacogenetics can guide the clinical implementation of individualized treatment. Single nucleotide polymorphisms (SNPs), as a genetic marker, contribute to the selection of appropriate chemotherapy regimens and dosages. Some SNPs are associated with folate metabolism, the therapeutic target of 5-FU. Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) rs1801131 and rs1801133, dihydrofolate reductase (DHFR) rs1650697 and rs442767, methionine synthase (MTR) rs1805087, gamma-glutamyl hydrolase (GGH) rs11545078 and solute carrier family 19 member 1 (SLC19A1) rs1051298 have been investigated in different kinds of cancers and antifolate antitumor drugs, which have potential forecasting and guiding significance for application of 5-FU. The ion torrent next-generation semiconductor sequencing technology can rapidly detect gastric cancer-related SNPs. Each time a base is extended in a DNA chain, an H+ will be released, causing local pH changes. The ionic sensor detects pH changes and converts chemical signals into digital signals, achieving sequencing by synthesis. This technique has low sample requirement, simple operation, low cost, and fast sequencing speed, which is beneficial for guiding individualized chemotherapy by SNPs.

This protocol proposes holistic laboratory procedures required to detect single nucleotide polymorphisms in gastric cancer samples based on an ion semiconductor sequencing platform. The target sequences, ligating adapters, library amplification and purification, and quality control criteria are also described in detail.