Die Analyse von Seitenpopulationszellen ist eine der am häufigsten verwendeten Methoden, um Krebsstammzellen aus Tumorgeweben und Tumorzelllinien zu isolieren und zu identifizieren. Dieser Assay ist bequem, schnell und kostengünstig. Diese Methode kann zu einem besseren Verständnis der Wirkung von Genen oder anderen extrazellulären und intrazellulären Signalen auf die Stammeigenschaften von Tumorzellen beitragen.
Viele Faktoren können den Prozentsatz der SP-Zellen in dieser Analyse beeinflussen, daher ist es wichtig, die richtigen Bedingungen vor dem formalen Experiment zu untersuchen. Samen Sie Tumorzellen in einer Sechs-Well-Platte und inkubieren Sie sie in einem 37-Grad-Celsius-Inkubator, der mit 5% Kohlendioxid versorgt wird. Wenn die Zelldichte etwa 90% erreicht, saugen Sie das Kulturmedium an und waschen Sie die Zellen zweimal mit drei Millilitern PBS.
Dann fügen Sie 500 Mikroliter von 0,25% Trypsin-EDTA zu jeder Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für ein bis drei Minuten. Klopfen Sie vorsichtig auf die Platte, um die Zellen zu lösen, fügen Sie drei Milliliter PBS mit 2% FBS zu jeder Vertiefung hinzu und pipetieren Sie die Zellen drei- bis fünfmal auf und ab, um die Zellklumpen zu dispergieren. Untersuchen Sie die Zellsuspension unter dem Mikroskop.
Wenn Zellklumpen vorhanden sind, leiten Sie die Suspension durch ein 70-Mikrometer-Sieb. Die Zellen werden in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen und fünf Minuten lang bei 200 g zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in drei Millilitern PBS, ergänzt mit 2% FBS, wieder auf und ab, wobei Die Zellen drei- bis fünfmal nach oben und unten pipettiert werden, um sich zu mischen.
Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer unter dem Mikroskop und verdünnen Sie sie in PBS, ergänzt mit 2% FPS, bis zu einer Endkonzentration von einmal 10 bis zu den sechs Zellen pro Milliliter. Bereiten Sie zwei Fünf-Milliliter-, Polystyrol-Rundboden-Reagenzgläser vor und fügen Sie jedem Röhrchen einen Milliliter der Zellsuspension hinzu. Kennzeichnen Sie ein Röhrchen als Reagenzglas und das andere als Blockersteuerrohr.
Bereiten Sie eine Blockerlösung vor, indem Sie sie auf die entsprechende Konzentration verdünnen. Fügen Sie es in das Blocker-Steuerrohr und mischen Sie es gut, dann inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten. Schütteln Sie die Tube alle 10 Minuten.
Bereiten Sie eine Lösung von Hoechst 33342 vor, indem Sie sie auf die entsprechende Konzentration verdünnen. Geben Sie es separat in das Reagenzglas und das Blockersteuerrohr und mischen Sie es gut, dann inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 Grad Celsius für 60 Minuten. Schütteln Sie die Röhrchen alle 10 Minuten.
Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 200 mal g und vier Grad Celsius und saugen dann vorsichtig den Überstand an. Resuspendieren Sie die Zellen in jedem Röhrchen mit einem Milliliter eiskaltem PBS, ergänzt mit 2% FBS, und pipetieren Sie dann die Zellen auf und ab, um sie zu mischen. Fügen Sie ein Mikroliter pro Milligramm pro Milliliter Propidiiumiodid oder PI zu jeder Tube hinzu und mischen Sie.
Klicken Sie in der Durchflusszytometer-Software auf die Registerkarte Parameter. Wählen Sie zunächst die Parameter FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red und PI aus. Wählen Sie zweitens die logarithmische Skala für den PI-Parameter aus.
Wählen Sie abschließend Flächen- und Breitenskalen für die Parameter FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red und PI aus. Führen Sie die Zellen zuerst aus dem Reagenzglas aus und lassen Sie dann die Zellen aus dem Blockersteuerrohr mit den gleichen Spannungen und Gattern laufen. Sammeln Sie 20 bis 100.000 Ereignisse aus jeder Probe, um den Prozentsatz der SP-Zellen zu analysieren.
Diese Methode wurde verwendet, um den Anteil von SP-Zellen in der MDA-MB-231 menschlichen Brustkrebszelllinie nachzuweisen. Das Punktdiagramm von FSC-A versus PI-A zeigte eine Population von toten Zellen, Zelltrümmern und der Hauptpopulation von PI-negativen Zellen, die einer weiteren Analyse unterzogen wurde. Eine Einzelzellpopulation, die aus dem Punktdiagramm von FSC-A versus FSC-W und dem Punktdiagramm von SSC-A versus SSC-W abgliedert wurde, wurde verwendet, um den Anteil der SP-Zellen zu analysieren, der in unbehandelten Zellen etwa 0,9% und in mit Reserpin behandelten Zellen etwa 0,09% betrug.
An MDA-MB-435-Zellen wurden unterschiedliche Färbekonzentrationen von Hoechst 33342 getestet und festgestellt, dass zwei Mikrogramm pro Milliliter für die SP-Analyse optimal waren. Niedrige Konzentrationen machten es schwierig, SP-Zellen von anderen Populationen zu unterscheiden, während hohe Konzentrationen sp-Zellen verschwinden ließen. Verapamil und Reserpin wurden getestet, um den richtigen Blocker für die MDA-MB-435-Zellen zu bestimmen.
Etwa 0,4% der Zellen stießen den Farbstoff nach der Verapamil-Behandlung aus, aber das Verhältnis sank nach der Reserpin-Behandlung auf etwa 0,1%, was zeigt, dass Reserpin ein geeigneterer Blocker für diese Zelllinie ist. Dieses Protokoll wurde auch verwendet, um den Anteil von SP-Zellen in A549-humanen Lungenadenokarzinomzellen, die mit STAT3-Aktivator Colivelin behandelt wurden, und in T47D-menschlichen Brustkrebszellen, die mit fra1-Inhibitor SKLB816 behandelt wurden, zu bestimmen. Dieser Assay liefert Hinweise auf die regulatorische Wirkung von Signalwegen auf die Eigenschaften von Krebsstammzellen und ermöglicht die Entdeckung neuer Mechanismen, die letztendlich die gezielte Therapie von Tumoren leiten können.
