Die Autoren bedanken sich bei James Oesterling für die Durchflusszytometrie Unterstützung danken. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der US-amerikanischen National Cancer Institute (R01-CA178380, ZY) und einer US-amerikanischen National Institute Postdoc-Stipendium (5T32CA009035-37, LWY) unterstützt.

Verwendung von Tieren in diesem Protokoll wurde in Übereinstimmung mit Verfahren, die von der Fox Chase Cancer Center Animal Care und Use Committee genehmigt durchgeführt. 1. Vorbereitung der Instrumente, Lösungen und Deckgläser <ol><li> Saubere zwei Sätze von # 5 feinen Pinzette, ein Satz von # 7 feinen gebogenen Pinzette, einer großen chirurgischen Schere, eine microdissecting Schere, einem Spachtel und einem Lochlöffel. Legen Sie die Instrumente in einer selbstdichtenden Sterilisationsbeutel und Autoklaven. Halten Sie die Geräte in Beutel bis zur Verwendung. </li><li> Bereiten Sie eine 3% niedriger Schmelztemperatur Agarose-Lösung. <ol><li> 1,5 g Agarose hinzufügen in 50 ml sterilem Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS), dann in der Mikrowelle und Wärme setzen, bis sich Blasen bilden. Swirl Kolben und Zwischenüberhitzung, bis alle Agarose gelöst hat. Mischen Lösung mit einem Rührstab vor dem Erhitzen, wenn Klumpen erscheinen. </li><li> Shop-Lösung in einem 37 ° C warmen Wasserbad, bis sie benötigt. </li><li> Für langfristige storage, speichern die Agarose-Lösung für eine spätere Verwendung bei Raumtemperatur oder bei 4 ° C für Monate. Aufwärmen in der Mikrowelle zu verflüssigen. Für wiederholte Erwärmung der Agarose-Lösung, der Kolben wiegen vor dem Erhitzen in seine Ausgangsgewicht mit warmem sterilem destilliertem Wasser zu halten. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die folgenden Lösungen für Papain-basierte Zell Dissoziation, wie zuvor beschrieben 2: <ol><li> Ein Papain-Lösung mit Papain (100 U / ml), Cystein (0,2 mg / ml) und DNase (250 U / ml) in sterilem Phenolrot enthaltende DPBS. </li><li> Eine Ovomucoid-Lösung mit Rinderserumalbumin (BSA, 8 mg / ml), Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor (8 mg / ml)) und DNase (250 U / ml) in sterilem Phenolrot enthaltende DPBS. Filter sterilisieren beide Lösungen und pH-Wert auf ursprüngliche Farbe der Phenol-Rot-haltigen DPBS zurückzukehren. </li></ol></li><li> Vorbereitung Zellkulturmedien (NB / B27): Ergänzung Basalmedium mit 1 mM Natriumpyruvat, 2 mM L-Glutamin, 1% Penicillin-Streptomycin (P / S) und B27 Supplement. Filter sterilisieren und vor Licht schützen. Äquilibrieren Medien bei 37 ° C und 5% CO 2 vor der Verwendung. </li><li> Vorbereitung FACS-Puffer: 5% fötalem Rinderserum (FBS) in DPBS. Fügen Sie 2,5 ml bis 47,5 ml FBS DPBS. </li><li> Vorbereitung Poly-D-Lysin (PDL) beschichteten Deckgläschen. <ol><li> Autoklaven neue Deckgläser. </li><li> Bestreichen Sie die Deckgläser mit PDL (100 ug / ml in sterilem destilliertem Wasser) und Inkubation für 2 Stunden bei 37 ° C oder Raumtemperatur über Nacht. </li><li> Waschdeckgläser mit sterilem destilliertem Wasser. Einmal mit NB / B27 Medien waschen. Lassen Deck vollständig trocknen in der Gewebekultur Haube vor der Verwendung. </li></ol></li></ol> 2. Dissection und Herstellung von Gewebeschnitten <ol><li> Am Tag der Präparation, wischen Sie die Dissektion Bereich mit 70% Ethanol und Abdeckung mit einem saugfähigen Unterlage. </li><li> Entfernen Dissektion Werkzeuge aus der Sterilisationsbeutel. Fügen eiskalt, sterile DPBS / 1% P / S zu einem kleinen Petrischale und auf Eis. </li><li> Enthaupten P4 Math1-GFP / Nestin-GFP Maus Welpen mit großen chirurgischen Schere halten dann den Kopf nach unten mit feinen gebogenen Pinzette. Entfernen Sie die Haut und vorsichtig abziehen der Schädel mit # 5 feinen Pinzette dann aushöhlen das Gehirn aus dem Schädel mit einem Spatel und überträgt es auf die Petrischale mit DPBS / 1% P / S. <ol><li> Verwendung von # 5 feinen Pinzette vorsichtig die Kleinhirn vom Rest des Gehirns. Achten Sie darauf, einen Welpen zu einem Zeitpunkt, so schnell wie möglich zu sezieren. </li><li> Sammeln ein Minimum von 8 Kleinhirn, um genügend NEPs für molekulare und funktionelle Analysen zu erhalten. </li></ol></li><li> Füllen Sie eine Einbettung Form von 2 x 2 x 2 cm mit 3% niedriger Schmelztemperatur Agarose-Lösung. Sicherzustellen, dass die Temperatur der Agarose nicht mehr als 37 ° C ist. </li><li> Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus Kleinhirn durch Abtupfen sanft auf einem Labor Gewebe. Zeigen Kleinhirn in die Form in eine vertikale Position. Legen Sie die Form auf Eis, damit es schnell zu verfestigen. Werden ~ 4 cerebella pro Block. </li><li> Erhalten liVing Gewebeschnitte mit einem vibrierenden Klinge Vibratom. Trim cerebella haltige Agarose-Block mit einer Rasierklinge. Kleben Sie die Agarose-Block auf die Platte Vibratom mit Kleinhirne in eine vertikale Position ausgerichtet. </li><li> Füllen Sie den Boden der Vibratom mit eiskaltem sterilen DPBS / 1% P / S und Ort Eis darunter. <ol><li> Schnitt 600 um Schnitte durch die gesamte Länge des Kleinhirns. Sammeln Abschnitte aus dem Eiswürfelschale mit einem perforierten Löffel. Platz Abschnitte in einer Petrischale mit DPBS / 1% P / S auf Eis gefüllt. </li></ol></li></ol> 3. Mikrodissektion und Zelldissoziation <ol><li> Legen Sie die Petrischale mit Gewebeschnitten unter einem Fluoreszenz-Binokular. <ol><li> Vorsichtig die EGL aus dem Rest der Kleinhirnschnitt mit feinen Pinzette durch Sezieren zwischen der GFP + Molekularschicht und der GFP + EGL (siehe gestrichelte Linie in Abbildung 1). Achten Sie darauf, jeden Teil des molekularen Schicht nicht enthalten, die dazu führen wirdKontamination von Nestin-exprimierenden Bergmann Gliazellen. </li><li> Führen Sie diesen Schritt so schnell wie möglich zu halten und das Gewebe auf Eis, um den Zelltod zu verhindern. </li><li> Entfernen Sie die Agarose die umgebenden Gewebe, bevor Sie zum nächsten Schritt. </li></ol></li><li> Digest mit einer Papain-basiertes Protokoll, wie zuvor beschrieben, 2 um eine Einzelzellsuspension zu erhalten, die microdissected EGL Gewebe. <ol><li> Resuspendieren Zellen in FACS-Puffer für die Sammlung der GFP-positiven Zellen über FACS. </li></ol></li></ol> 4. Zellsortierung und Oberflächen <ol><li> Sortieren Zellen für GFP-Fluoreszenz mit einer sterilen, Hochgeschwindigkeits Durchflusszytometer, die eine geeignete GFP-Filter und sammeln Zellen in FACS-Puffer auf Eis. Erhalten rund 100.000 NEPs von jedem P4 Kleinhirn. </li><li> Zentrifuge Zellen bei 300 g für 5 min. Verwenden Zellen sofort für die molekulare Analyse oder Kultur für weitere Experimente. </li><li> Zur Kultivierung von Zellen, Wieder die Zellen in vorgewärmte NB / B27 medien und Platte auf PDL-beschichtete Deckgläser wie zuvor beschrieben 2. </li></ol>

<ol>
	<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum.">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).</li><li>Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medulloblastoma+can+be+initiated+by+deletion+of+Patched+in+lineage-restricted+progenitors+or+stem+cells.">Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells.</a> Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).</li><li>Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. 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M., Frain, M., Vernet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+plasticity+of+adult+Bergmann+fibers+is+associated+with+radial+migration+of+grafted+Purkinje+cells.">Molecular plasticity of adult Bergmann fibers is associated with radial migration of grafted Purkinje cells.</a> J Neurosci. 14, 124-133 (1994).</li><li>Lumpkin, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1-driven+GFP+expression+in+the+developing+nervous+system+of+transgenic+mice.">Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice.</a> Gene Expr Patterns. 3, 389-395 (2003).</li><li>Encinas, J. M., Vaahtokari, A., Enikolopov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoxetine+targets+early+progenitor+cells+in+the+adult+brain.">Fluoxetine targets early progenitor cells in the adult brain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8233-8238 (2006).</li><li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+regulation+of+astroglial+morphology+and+proliferation+in+vitro.">Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro.</a> J Cell Biol. 100, 384-396 (1985).</li><li>Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+post-natal+mouse+cerebellar+granule+neuron+progenitor+cells+and+neurons.">Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons.</a> J Vis Exp. (23), (2009).</li><li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274, 998-1001 (1996).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nat Protoc. 1, 586-603 (2006).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die hier beschriebene Mikrodissektionsverfahren ist das erste Verfahren in der Lage, eine reine Population von lebenden Zellen für den Einsatz in der molekularen und funktionellen Analysen zu isolieren. Wie von Li et al. 9 gezeigt, NEP durch dieses Verfahren erhalten werden, können kultiviert werden und in verschiedenen Versuchen integriert werden und aufgrund ihrer hohen Reinheit kann auch für die Microarray-Analyse eingesetzt werden. Es ist sehr wichtig, s...

Das Kleinhirn aus mehreren Zellschichten, die jeweils verschiedene Zelltypen umfassen. Während der Entwicklung der EGL enthält wuchernden Granulat Neuron Vorstufen (BSP), während die Molekularschicht und Purkinje-Schicht enthalten Bergmann Gliazellen und Neuronen Purkinje auf. Tief im Kleinhirn liegt die weiße Substanz, die neurale Stammzellen (NSCs) und Oligodendrozyten 1 enthält. Sonic Hedgehog (Shh) spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Kleinhirnentwicklung und insbesondere fördert sie die Verbreitung von BSP über die Bindung an seinen Rezeptor Patched (PTC), einem negativen Regulator der Shh-Signal 2-4. Abweichende Aktivierung des Shh-Signal erzeugt Medulloblastom (MB), der häufigsten bösartigen Hirntumor bei Kindern 5,6. PTC-Mutante MB transgenen Mausmodellen sind leistungsfähige Werkzeuge für die Untersuchung von MB und entwickeln Tumoren menschlichen MB 7,8 ähnelt. Mit diesenMäusen wurde festgestellt, dass BSP sind die Ursprungszelle für Hedgehog-Aktivität MB 7. Ferner, zusätzlich zu BSP, haben wir kürzlich eine einzigartige Population von neuronalen Vorläuferzellen in der EGL des Kleinhirns, die auch die Entwicklung hervorrufen können MB identifiziert. Diese Zellen exprimieren hohe Konzentrationen des Typs VI Intermediärfilament Protein, Nestin, und werden als NEP 9. NEP werden im tiefen Teil der EGL befindet und existieren nur in Neugeborenen vorübergehend Kleinhirnentwicklung. Sie sind auf der Körnerzelllinie als BSP verpflichtet, sondern sind verschieden, wie sie sind und nicht Ruhe Math1, eine gut etablierte Marker für herkömmliche BSP 10 auszudrücken. Darüber hinaus geben Anlass zu NEP MB effizienter als BSP nach Aktivierung des Shh-Signalweg 9, die sie zu einem neuen Ausgangspunkt für MB Tumorentstehung spielt. Wir haben vorher isoliert NEPs aus der Kleinhirn EGL am postnatalen Tag 4 (P4) durch die Mikrodissektion Technikhier 9 beschrieben. Mikrodissektion über direkte mikroskopische Visualisierung des Gewebes ermöglicht spezifische Präparation der Kleinhirn EGL. Dies ist notwendig, da Nestin auch von NSC in der Klein weißen Substanz und von Bergmann Glia in der Molekularschicht 1,7,11,12 ausgedrückt und es war von entscheidender Bedeutung, dass diese Zellen nicht aufgenommen werden, da sie Analyse verwechseln. Zellen, die aus Gewebe isoliert microdissected kann sofort für die molekulare Analyse verwendet werden, oder sie kann für weitere Anwendungen kultiviert werden. Auf staatliche Beihilfen, die speziell microdissecting die EGL und zur weiteren Reinigung Nissen, wurden Math1-GFP (green fluorescent protein)-Mäusen mit Nestin-GFP (cyan fluorescent protein)-Mäusen gekreuzt. Der Transkriptionsfaktor Math1 wird speziell durch BSP und GFP-Expression ausgedrückt ist in der EGL 9,13 deutlich sichtbar. Nestin-GFP-Mäuse exprimieren eine Kern Form von GFP und kann leicht in der Molekularschicht 9,14 visualisiert werden. Zusammen, GFP und GFP-Expression zu erstellen Grenzen für die Mikrodissektion der EGL (siehe Abbildung 1). GFP-positiven NEPs wurden dann durch FACS isoliert, nach enzymatischer Spaltung der beschäftigungspolitischen Leitlinien seziert. Derzeit ist das Verfahren auch verwendet, um Zellen von der EGL isolieren Percoll-Gradienten-Zentrifugation von Vollkleinhirngewebe 15,16. Dieses Verfahren ist jedoch nicht Nestin +-Zellpopulationen aus der Molekularschicht und der weißen Substanz vollständig ausschließen und kann daher nicht für die Untersuchung der NEP verwendet werden. Laser Mikrodissektion, die die Übertragung von Laserenergie verwendet, um Zellen von Interesse zu entfernen, ist eine andere verwendet, um bestimmte Zellen in einer heterogenen Gewebe 17,18 isolieren, sondern gefangenen Zellen können nur zur Gewinnung von DNA, RNA und Protein verwendet werden und sind nicht Verfahren Lage, kultiviert werden. Dieses Protokoll bietet eine Möglichkeit, gezielt isolieren eine lebendige, reine Population Nissen von der EGL.Diese Technik kann auch auf verschiedene Gewebearten, die entweder erkennbar anatomischen Architektur oder fluoreszenzmarkierten Zellen / Regionen angewendet werden. Daher ist der große Vorteil der Einbeziehung dieser neuartigen Mikropräparationsverfahren in Zellisolierungsprotokolle, die Zellen von bestimmten Gewebebereichen getrennt werden, zu beseitigen kontaminierenden benachbarte Gewebe und die Zellen können sofort für eine Analyse oder für andere Anwendungen kultiviert gesammelt werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="572">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Neurobasal media</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">PDL</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">ultra pure low melting temperature agarose</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">16520-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">DPBS</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of distinct cell populations from the developing cerebellum by microdissection

Mikrodissektion ist eine neuartige Technik, die spezifische Regionen eines Gewebe zu isolieren und Verunreinigungen zu beseitigen aus zellulären Quellen in benachbarten Bereichen können. Dieses Verfahren wurde in der Studie verwendet Nestin exprimieren Progenitoren (NEP), einem neu identifizierten Population von Zellen in der Klein externe Keimschicht (EGL). Verwendung Mikrodissektion in Kombination mit fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) wurde eine reine Population Nissen getrennt von herkömmlichen Granulat Neuron Vorstufen in EGL und von anderen kontaminierenden Nestin-exprimierenden Zellen im Kleinhirn gesammelt. Ohne Mikrodissektion würde funktionelle Analysen Nissen nicht mit der aktuellen Methoden zur Verfügung, wie Percoll-Gradienten-Zentrifugation und die Laser Mikrodissektion möglich. Diese Technik kann auch für die Verwendung mit verschiedenen Geweben, die entweder erkennbar Regionen oder fluoreszenzmarkierten Zellen enthalten eingesetzt werden. Am wichtigsten ist, ein wesentlicher Vorteil dieser microdissection Technik ist, dass isolierte Zellen leben und kann für weitere Experimente, die derzeit mit anderen beschriebenen Methoden nicht möglich ist kultiviert werden.

Wie in 1A gezeigt, wurden Kleinhirnschnitten von P4 Math1-GFP / Nestin-GFP-Mäuse hergestellt, in dem der Kleinhirn EGL wurde von GFP-exprimierenden BSP dominiert und die Molekularschicht wurde durch GFP-positive Gliazellen angereichert. (; 1A entlang gestrichelte Linie) zu NEP, die in den tiefen Teil der EGL befinden isolieren, wurden Scheiben zwischen der EGL und der Molekularschicht mikrodissektiert. Anatomisches BPLL (1B) wurden dann für die enzym...

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Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Nestin-exprimierenden Vorläuferzellen sind eine neu identifizierte Population von neuronalen Vorläuferzellen im sich entwickelnden Kleinhirn. Verwendung des Mikropräparationstechnik hier in Kombination mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung dargestellt, können diese Zellpopulation ohne Verunreinigung durch andere Kleinhirnregionen, gereinigt werden und kann für weitere Untersuchungen kultiviert werden.

Isolation von unterschiedlichen Zellpopulationen aus sich entwickelnden Kleinhirn durch Mikrodissektion

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.5K Aufrufe.  Temple University Health System.  Nestin-exprimierenden Vorläuferzellen sind eine neu identifizierte Population von neuronalen Vorläuferzellen im sich entwickelnden Kleinhirn. Verwendung des Mikropräparationstechnik hier in Kombination mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung dargestellt, können diese Zellpopulation ohne Verunreinigung durch andere Kleinhirnregionen, gereinigt werden und kann für weitere Untersuchungen kultiviert werden. 

Serie: Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack conspicuous morphological features or show a low population density. This applies particularly to retinal amacrine cells, an exceptionally multiform class of interneurons that comprise roughly 30 subtypes in mammals1. Though being a crucial part of the visual processing by shaping the retinal output2, most of these subtypes have not been studied up to now in a functional context because encountering these cells with a recording electrode is a rare event.
Recently, a multitude of transgenic mouse lines is available that express fluorescent markers like green fluorescent protein (GFP) under the control of promoters for membrane receptors or enzymes that are specific to only a subset of neurons in a given tissue3,4. These pre-labeled cells are therefore accessible to directed microelectrode targeting under microscopic control, permitting the systematic study of their physiological properties in situ. However, excitation of fluorescent markers is accompanied by the risk of phototoxicity for the living tissue. In the retina, this approach is additionally hampered by the problem that excitation light causes appropriate stimulation of the photoreceptors, thus inflicting photopigment bleaching and transferring the retinal circuits into a light-adapted condition. These drawbacks are overcome by using infrared excitation delivered by a mode-locked laser in short pulses of the femtosecond range. Two-photon excitation provides energy sufficient for fluorophore excitation and at the same time restricts the excitation to a small tissue volume minimizing the hazards of photodamage5. Also, it leaves the retina responsive to visual stimuli since infrared light (&gt;850 nm) is only poorly absorbed by photopigments6.
In this article we demonstrate the use of a transgenic mouse retina to attain electrophysiological in situ recordings from GFP-expressing cells that are visually targeted by two-photon excitation. The retina is prepared and maintained in darkness and can be subjected to optical stimuli which are projected through the condenser of the microscope (Figure 1). Patch-clamp recording of light responses can be combined with dye filling to reveal the morphology and to check for gap junction-mediated dye coupling to neighboring cells, so that the target cell can by studied on different experimental levels.

This article depicts the recording of individual cells from fluorescently tagged neuronal populations in the intact mouse retina. By using two-photon infrared excitation transgenetically labeled cells were targeted for patch-clamp recording to study their light responses, receptive field properties, and morphology.

Elektrophysiologische Charakterisierung von GFP-exprimierenden Zellpopulationen in der intakte Retina

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

Forschung

Neurowissenschaften

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

Laser Capture Mikrodissektion von Angereichert Populationen von Neuronen oder Single Neurons zur Genexpressionsanalyse Nach Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or between the same cell type in health and disease or following pharmacologic treatments.&#160;In the spinal cord, such preparation from motor neurons, the target of interest in many neurologic and neurodegenerative diseases, is complicated by the fact that motor neurons represent &#60;10% of the total cell population.&#160;Laser capture microdissection (LMD) has been developed to address this problem.&#160;Here, we describe a protocol to quickly recover, freeze, and section mouse spinal cord to avoid RNA damage by endogenous and exogenous RNases, followed by staining with Azure B in 70% ethanol to identify the motor neurons while keeping endogenous RNase inhibited.&#160;LMD is then used to capture the stained neurons directly into guanidine thiocyanate lysis buffer, maintaining RNA integrity.&#160;Standard techniques are used to recover the total RNA and measure its integrity.&#160;This material can then be used for downstream analysis of the transcripts by RNA-seq and qRT-PCR.

High-quality total RNA has been prepared from cell bodies of mouse spinal cord motor neurons by laser capture microdissection after staining spinal cord sections with Azure B in 70% ethanol.&#160;Sufficient RNA (~40-60 ng) is recovered from 3,000-4,000 motor neurons to allow downstream RNA analysis by RNA-seq and qRT-PCR.

Produktion von RNA für die Transkriptomische Analyse von Maus Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies durch Laser Capture Microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Live-Imaging der Mitose in der Entwicklung von embryonalen Maus-Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

Laser Mikrodissektion - Eine Demonstration der Isolation der einzelnen Dopamin-Neuronen und die gesamte ventrale Tegmentum

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

In eingehenden Physiologische Analyse definierter Zellpopulationen bei der akuten Gewebeschnitten der Maus Vomeronasalorgans

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Live Imaging Followed by Single Cell Tracking to Monitor Cell Biology and the Lineage Progression of Multiple Neural Populations

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate decisions, will be crucial to design therapeutic strategies for many diseases affecting the nervous system. Current methods to track cell populations rely on their final outcomes in still images and they generally fail to provide sufficient temporal resolution to identify behavioral features in single cells. Moreover, variations in cell death, behavioral heterogeneity within a cell population, dilution, spreading, or the low efficiency of the markers used to analyze cells are all important handicaps that will lead to incomplete or incorrect read-outs of the results. Conversely, performing live imaging and single cell tracking under appropriate conditions represents a powerful tool to monitor each of these events. Here, a time-lapse video-microscopy protocol, followed by post-processing, is described to track neural populations with single cell resolution, employing specific software. The methods described enable researchers to address essential questions regarding the cell biology and lineage progression of distinct neural populations.

A robust protocol to monitor neural populations by time-lapse video-microscopy followed by software-based post-processing is described. This method represents a powerful tool to identify biological events in a selected population during live imaging experiments.

Leben Sie Imaging, gefolgt von einzelligen Tracking Monitor Zellbiologie und die Linie Fortschreiten der mehrere neuronalen Populationen

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). We have identified five steps in the workflow that are crucial for obtaining RNA isolates from enteric ganglia with sufficiently high quality and quantity for RNA-seq. First, when preparing intestinal tissue, each sample must have all excess liquid removed by blotting prior to flattening the serosa as much as possible across the bottom of large base molds. Samples are then quickly frozen atop a slurry of dry ice and 2-methylbutane. Second, when sectioning the tissue, it is important to position cryomolds so that intestinal sections parallel the full plane of the myenteric plexus, thereby yielding the greatest surface area of enteric ganglia per slide. Third, during LCM, polyethylene napthalate (PEN)-membrane slides offer the greatest speed and flexibility in outlining the non-uniform shapes of enteric ganglia when collecting enteric ganglia. Fourth, for distinct visualization of enteric ganglia within sections, ethanol-compatible dyes, like Cresyl Violet, offer excellent preservation of RNA integrity relative to aqueous dyes. Finally, for the extraction of RNA from captured ganglia, we observed differences between commercial RNA extraction kits that yielded superior RNA quantity and quality, while eliminating DNA contamination. Optimization of these factors in the current protocol greatly accelerates the workflow and yields enteric ganglia samples with exceptional RNA quality and quantity.

The goal of this protocol is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia isolated from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). This protocol involves preparing flash-frozen samples of human intestinal tissue, cryosectioning, ethanolic staining and dehydration, LCM, and RNA extraction.

Optimierung der Capture-Laser Mikrodissektion für die Isolierung der enterischen Ganglien aus menschlichem Gewebe Tiefkühlfrische

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or regions from heterogenous tissues. Captured product can be used in a variety of molecular methods for protein, DNA or RNA isolation. However, preservation of RNA from postmortem human brain tissue is especially challenging. Standard visualization techniques for LCM require histologic or immunohistochemical staining procedures that can further degrade RNA. Therefore, we designed a stainless protocol for visualization in LCM with the intended purpose of preserving RNA integrity in post-mortem human brain tissue. The Purkinje cell of the cerebellum is a good candidate for stainless visualization, due to its size and characteristic location. The cerebellar cortex has distinct layers that differ in cell density, making them a good archetype to identify under high magnification microscopy. Purkinje cells are large neurons situated between the granule cell layer, which is a densely cellular network of small neurons, and the molecular layer, which is sparse in cell bodies. Because of this architecture, the use of stainless visualization is feasible. Other organ or cell systems that mimic this phenotype would also be suitable. The stainless protocol is designed to fix fresh-frozen tissue with ethanol and remove lipids with xylene for improved morphological visualization under high magnification light microscopy. This protocol does not account for other fixation methods and is specifically designed for fresh-frozen tissue samples captured using an ultraviolet (UV)-LCM system. Here, we present a full protocol for sectioning and fixing fresh frozen post-mortem human cerebellar tissue and purification of RNA from Purkinje cells isolated by UV-LCM, while preserving RNA quality for subsequent RNA-sequencing. In our hands, this protocol produces exceptional levels of cellular visualization without the need for staining reagents and yields RNA with high RNA integrity numbers (&#8805;8) as needed for transcriptional profiling experiments.

This protocol uses a stain-free approach to visualize and isolate Purkinje cells in fresh-frozen tissue from human post-mortem cerebellum via laser capture microdissection. The purpose of this protocol is to generate sufficient amounts of high-quality RNA for RNA-sequencing.

Ein Edelstahl-Protokoll für hochwertige RNA Isolation aus Laser Capture Microdissected Purkinje-Zellen im menschlichen Post-Mortem Kleinhirn

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model system is to provide a controlled microenvironment and maintain the high survival rate and the natural features of dissociated neuronal and nonneuronal cells as much as possible under in vitro conditions. In this article, we demonstrate a method of isolating primary neurons from the developing mouse cerebellum, placing them in an in vitro environment, establishing their growth, and monitoring their viability and differentiation for several weeks. This method is applicable to embryonic neurons dissociated from cerebellum between embryonic days 12&ndash;18.

Conducting in vitro experiments to reflect in vivo conditions as adequately as possible is not an easy task. The use of primary cell cultures is an important step toward understanding cell biology in a whole organism. The provided protocol outlines how to successfully grow and culture embryonic mouse cerebellar neurons.

Primäre Kultur der Neuronen isoliert von Embryonal Mouse Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...