La toxicidad celular de Nanogenomedicine en la línea celular MCF-7: ensayo de MTT

Resumen

El ensayo de MTT es un ensayo colorimétrico fácil y reproducible para la evaluación de la viabilidad celular basado en la reducción de MTT amarilla y la producción de agua morada formazán insoluble. En este caso, la viabilidad de las células MCF-7 sobre el tratamiento de nanogenomedicine ha sido evaluada.

Resumen

Citotoxicidad de los nanogenomedicine futurista (por ejemplo, corto de interferencia de ARN antisentido y) puede obstaculizar su desarrollo clínico. De ellos, la medicina basada en genes y / o su compañía pueden provocar toxicidad celular. Para la evaluación de la citotoxicidad como, una metodología común depende en gran medida la utilización de la 3 - (4, 5-dimetil-2-tiazolil) -2, 5-difenil-2H-tetrazolio (MTT) de ensayo que ha sido ampliamente utilizado como un enfoque colorimétrico basado en la actividad de las enzimas deshidrogenasa mitocondrial de las células. En esta investigación actual, células MCF-7 fueron inoculadas en placa de 96 pocillos y en la confluencia del 50% fueron tratados con nanopolyplexes diferentes y sometidos a ensayo MTT después de 24 horas. Agua amarilla MTT soluble es metabolizado por las células metabólicamente activas para el agua insoluble formazán púrpura, que se ve disuelta en buffer de pH dimetilsulfóxido y Sornson s 10,5. El producto resultante puede ser cuantificado por espectrofotometría utilizando un lector de placas a 570 nm.

Protocolo

MCF-7 de siembra en placa de 96 pocillos:

MCF-7 células fueron cultivadas en 25 t-matraz en un medio que contiene Dulbecco Modificado Medio Eagle (DMEM), 10% de SFB, 100 penicilina U / ml, y 100 estreptomicina mg / ml a 37 ° C con 5% _CO2, 95% aire y la humedad total. Una vez llegado a 90% de confluencia, se separaron con 0,05% de tripsina / EDTA y se cuentan por medio de azul de tripano y un hemocitómetro. Estas células se resuspendieron luego en una concentración de 4 × 10 ⁴ células / cm ^2, y añadió en placa de 96 pocillos (es decir, 250 l / pocillo) por una pipeta de 8 canales. Para la absorción de fondo, algunos pozos se mantuvo libre de células, es decir, como el control en blanco.

El tratamiento de células con nanopolyplexes diferentes:

A 40-50% de confluencia (48 horas después de la siembra), las células cultivadas fueron tratadas con dendrímeros nanoestructurados estelar poliamidoamina (es decir, ® y ® Superfect Polyfect) y un polímero prueba novela siguiendo las instrucciones de transfección proporcionada por los proveedores. Las células fueron tratadas también con EGFR y revueltos antisentido solo, y con los tres nanopolyplexes diferentes de estos dos oligonucleótidos y con polímeros (n = 4). Cuatro pozos se quedó sin tratar como control. Después de 4 horas los medios de comunicación el tratamiento fueron retirados y se repone con medio fresco.

MTT ensayo para evaluar la viabilidad de las células:

MTT ensayo se llevó a cabo 24 horas después de la transfección. Para ello, la solución de MTT se ha preparado a 1mg/ml en PBS y se filtró a través de un filtro de 0,2 micras. Entonces, 50 l de MTT más 200 l de DMEM sin rojo fenol se añadieron a cada pocillo, con excepción de los pozos en blanco libre de células. Las células fueron incubadas durante 4 horas a 37 º C con CO2 al _5%, 95% de aire y la humedad total. Después de 4 horas, la solución de MTT fue removido y reemplazado con 200 l de DMSO y glicina 25μl Sorenson buffer (glicina 0,1 M, NaCl 0,1 M, pH: 10,5 a 0,1 NaOH). La placa se incubó durante 5 min a temperatura ambiente, y la densidad óptica (DO) de los pozos se determinó usando un lector de placas a una longitud de onda de prueba de 570 nm y una longitud de onda de referencia de 630 nm.

Discusión

El ensayo de MTT se considera que es un método versátil y, en consecuencia la viabilidad de las células podrían ser evaluados en diversos tratamientos. La producción de formazán resultante parece ser proporcional al nivel de metabolismo de la energía en las células. Por lo tanto, es posible medir las células metabólicamente activa, incluso en ausencia de la proliferación celular. La cantidad de formazán producida es proporcional a la cantidad de MTT en el medio de incubación. Mientras, la concentración de ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 t-flask	Orange Scientific	5510100
PBS	Sigma-Aldrich	P3813
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	D5671
MTT	Sigma-Aldrich	M2128
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Penicillin 200,000 u/ml	CinnaGen	CR7913
Streptomycin 200 mg/ml	CinnaGen	CR7912
trypsin/EDTA	Sigma-Aldrich	T3924
trypan blue	Sigma-Aldrich	T8154
Superfect	Qiagen	301105
Polyfect	Qiagen	301305
EGFR antisense	Eurofins MWG Operon
Scrambled antisense	Eurofins MWG Operon
DMEM without phenol red	GIBCO, by Life Technologies	11880
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898
hemocytometer	HBG
8-channel pipette	TreffLab Transferpette	96.9918.10.1
Disposable syringe filter	Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.	2052-025
Plate reader equipped with 570 nm &630 nm filters	BioTek	ELX808
96-well plate with lid (flat bottom)	Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.	3860-096
Laminar flow hood	Esco Products
CO2 Incubator	ASTEC