Сотовая Токсичность Nanogenomedicine в MCF-7, клеточная линия: МТТ анализа

Резюме

Анализ МТТ является простым и воспроизводимым колориметрического анализа для оценки жизнеспособности клеток, основанный на уменьшении желтого МТТ и производство нерастворимые в воде фиолетовый формазана. Здесь, жизнеспособность MCF-7 клеток при лечении nanogenomedicine была оценена.

Аннотация

Цитотоксичность футуристический nanogenomedicine (например, коротких интерферирующих РНК и антисмысловых), могут помешать его клинической разработки. Из них ген медицины и / или ее носитель может вызывать сотовой токсичности. Для оценки таких цитотоксичность, общая методология во многом зависит от использования 3 - (4, 5-диметил-2-тиазолил) -2, 5-дифенил-2H-тетразолия бромид (МТТ) анализа, который широко используется в качестве колориметрического подхода, основанного на активности митохондриальных ферментов дегидрогеназы в клетках. В нынешней расследования, MCF-7 клеток были привиты в 96-луночного планшета и при 50% слияния с ними обращались с различными nanopolyplexes и подвергается МТТ анализ после 24 часов. Водорастворимые желтого МТТ метаболизируется метаболически активных клеток в нерастворимые в воде фиолетовый формазана, который далее растворяется в буфере рН диметилсульфоксида и Sornson с 10,5. Полученный продукт может быть определена количественно спектрофотометрически использованием ридер при 570 нм.

протокол

MCF-7 посева в 96-луночного планшета:

MCF-7 клетки культивировали в 25 т-колбу в среде, содержащей Средний Дульбеко изменения Орла (DMEM), 10% ЭТС, 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина при 37 ° C с 5% CO _2, 95% воздух и полное влажности. Как только достигли ~ 90% слияния, они были отделены использованием 0,05% трипсин / ЭДТА и рассчитывал с помощью трипанового синий и гемоцитометра. Эти клетки затем ресуспендировали в концентрации 4 × 10 ^{4 клеток} / см ² и дополнен 96-луночного планшета (т.е., 250 мкл / лунку) на 8-канальная пипетка. Для фона поглощения, некоторые скважины остались бесклеточных, то есть как пустые контроля.

Лечение клеток с разными nanopolyplexes:

На 40-50% слияния (48 ч после посева), культивируемые клетки обрабатывали наноструктурированных звездообразования полиамидоамин дендримеров (т.е. Superfect ® и Polyfect ®) и роман полимера испытание, после трансфекции инструкции предоставляемые поставщиком. Клетки также рассматривается с EGFR и омлет антисмысловых в одиночку, и с трех разных nanopolyplexes этих двух олигонуклеотидов и с полимерами (п = 4). Четыре скважины остались необработанными в качестве контроля. Через 4 часа лечения СМИ были удалены, и пополняется свежей информации.

МТТ-тест для оценки жизнеспособности клеток:

МТТ анализ был выполнен через 24 часа после трансфекции. С этой целью МТТ решения был подготовлен на 1mg/ml в ФБР и фильтруют через фильтр 0,2 мкм. Затем, 50 мкл МТТ плюс 200 мкл DMEM без фенола красного были добавлены в каждую лунку, за исключением бесклеточной пустой скважины. Клетки инкубировали в течение 4 часов при температуре 37 ° C с 5% CO _2, 95% воздуха и полное влажности. После 4 часов раствор МТТ был удален и заменен 200 мкл ДМСО и 25 мкл Соренсона глицин буфере (0,1 М глицин, NaCl 0,1 М, рН: 10,5 с 0,1 NaOH). Пластины дальнейшего инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре и оптической плотности (ОП) скважин определялась с помощью ридер на тест длине волны 570 нм и референтной длине волны 630 нм.

Обсуждение

Анализ МТТ считается универсальным методом и, соответственно, жизнеспособность клетки могут быть оценены на различных методов лечения. Производство результирующая формазана, как представляется, пропорционально уровню энергетического обмена в клетках. Таким образом, можно измерить ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 t-flask	Orange Scientific	5510100
PBS	Sigma-Aldrich	P3813
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	D5671
MTT	Sigma-Aldrich	M2128
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Penicillin 200,000 u/ml	CinnaGen	CR7913
Streptomycin 200 mg/ml	CinnaGen	CR7912
trypsin/EDTA	Sigma-Aldrich	T3924
trypan blue	Sigma-Aldrich	T8154
Superfect	Qiagen	301105
Polyfect	Qiagen	301305
EGFR antisense	Eurofins MWG Operon
Scrambled antisense	Eurofins MWG Operon
DMEM without phenol red	GIBCO, by Life Technologies	11880
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898
hemocytometer	HBG
8-channel pipette	TreffLab Transferpette	96.9918.10.1
Disposable syringe filter	Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.	2052-025
Plate reader equipped with 570 nm &630 nm filters	BioTek	ELX808
96-well plate with lid (flat bottom)	Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.	3860-096
Laminar flow hood	Esco Products
CO2 Incubator	ASTEC