MCF - 7細胞株におけるNanogenomedicineの細胞毒性：MTTアッセイ

要約

MTTアッセイは、水不溶性の紫色ホルマザンの黄色のMTTと生産の減少に基づいて細胞生存率の評価のための簡単​​かつ再現可能な比色アッセイである。ここでは、nanogenomedicineの治療時にMCF - 7細胞の生存率が評価されています。

要約

未来nanogenomedicine（例えば、短干渉RNAおよびアンチセンス）の細胞毒性は、臨床開発を妨げる可能性があります。これらのうち、遺伝子ベースの医学および/またはそのキャリアは、細胞毒性を誘発し得る。このような細胞毒性の評価のために、一般的な方法論は、3の利用率に大きく依存します - として広く使用されている（4,5 - ジメチル-2 - チアゾリル）-2、5 - ジフェニル- 2H -テトラゾリウムブロマイド（MTT）アッセイ細胞内のミトコンドリアのデヒドロゲナーゼの酵素の活性に基づいて比色分析的なアプローチ。この現在の調査では、MCF - 7細胞を96ウェルプレートにし、50％コンフルエントで接種された彼らは、24時間後に別のnanopolyplexesで処理し、MTTアッセイを行った。水溶性黄色のMTTは、さらにジメチルスルホキシドとSornsonの緩衝液pH 10.5に溶解して水不溶性の紫色ホルマザンへの代謝活性を有する細胞で代謝される。得られた生成物は、570nmでプレートリーダーを用いて分光光度法により定量することができる。

プロトコル

MCF - 7を96ウェルプレートに播種。

MCF - 7細胞は、37ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）、10％FBS、100 U / mlペニシリン、および100μg/ mlのストレプトマイシンを含む培地中で25 T -フラスコで培養し、℃、5％CO _2、95％空気と完全な湿度。一度〜90％コンフルエントに達した、彼らを0.05％トリプシン/ EDTAを用いて分離し、トリパンブルーや血球計算盤により計数した。これらの細胞を4 × 10 ⁴細胞/ cm ²で再懸濁し、8チャンネルピ ​​ペットで（すなわち、250μl/ウェル）を96ウェルプレートに追加されました。バックグラウンド吸収のために、いくつかのウェルはブランクコントロールとして無細胞、すなわちままであった。

異なるnanopolyplexesで細胞を処理する：

コンフルエント40から50パーセント（48時間後播種）で、培養細胞は、ナノ構造のスターバーストポリアミドアミンデンドリマー（すなわち、Superfect ®およびPolyfect ®）と供給業者から提供されたトランスフェクションの命令に続く新たなテストのポリマーで処理した。細胞はまた、EGFRで処理し、一人でアンチセンスをスクランブルされ、そしてこれら2つのオリゴヌクレオチドの3つの異なるnanopolyplexesと、ポリマー（n = 4）を持つ。 4つのウェルはコントロールとして未処理のままであった。 4時間後に治療の媒体を除去し、新鮮な培地を補充。

細胞の生存率を評価するためのMTTアッセイ：

MTTアッセイは、トランスフェクションの24時間後に行った。この目的のために、MTT溶液をPBSで1mg/mlに調製し、0.2μmのフィルターで濾過した。その後、MTTを加えたフェノールレッドを含まないDMEM200μlを50μlの無細胞ブランクウェルを除き、各ウェルに加えた。細胞は37℃で4時間インキュベートした℃、5％CO _2、95％空気と完全な湿度。 4時間後、MTT溶液を除去し、DMSOおよび25μlのソレンソンのグリシンバッファー（グリシン0.1MのNaCl 0.1M、pH値：10.5 0.1 NaOHで）200μlで置き換えられました。プレートは、さらに室温で5分間インキュベートし、井戸の光学密度（OD）を570nmのテストの波長と630nmの基準波長でプレートリーダーを用いて決定した。

ディスカッション

MTTアッセイは、汎用的な方法とみなされ、それに応じて細胞の生存率は、様々な治療法により評価することができた。結果ホルマザンの産生は細胞内のエネルギー代謝のレベルに比例するように見えます。したがって、それも細胞増殖がない場合に代謝的に活性化された細胞を測定することが可能です。生成されたホルマザンの量は、培養培地中のMTTの量に比例する。一方で、生産ホルマザ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 t-flask	Orange Scientific	5510100
PBS	Sigma-Aldrich	P3813
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	D5671
MTT	Sigma-Aldrich	M2128
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Penicillin 200,000 u/ml	CinnaGen	CR7913
Streptomycin 200 mg/ml	CinnaGen	CR7912
trypsin/EDTA	Sigma-Aldrich	T3924
trypan blue	Sigma-Aldrich	T8154
Superfect	Qiagen	301105
Polyfect	Qiagen	301305
EGFR antisense	Eurofins MWG Operon
Scrambled antisense	Eurofins MWG Operon
DMEM without phenol red	GIBCO, by Life Technologies	11880
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898
hemocytometer	HBG
8-channel pipette	TreffLab Transferpette	96.9918.10.1
Disposable syringe filter	Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.	2052-025
Plate reader equipped with 570 nm &630 nm filters	BioTek	ELX808
96-well plate with lid (flat bottom)	Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.	3860-096
Laminar flow hood	Esco Products
CO2 Incubator	ASTEC