Zelluläre Toxizität von Nanogenomedicine in MCF-7 Zelllinie: MTT-Assay

Zusammenfassung

Der MTT-Test ist eine einfache und reproduzierbare Farbtestverfahren zur Beurteilung der Lebensfähigkeit der Zellen basiert auf Reduktion der gelben MTT und Produktion von wasserunlöslichen Formazan lila. Hier hat sich die Rentabilität der MCF-7 Zellen nach Behandlung von nanogenomedicine ausgewertet worden.

Zusammenfassung

Zytotoxizität der futuristischen nanogenomedicine (zB short interfering RNA und antisense) behindern können ihre klinischen Entwicklung. Von diesen kann das Gen-basierten Medizin und / oder seinem Träger zu entlocken Zelltoxizität. Für die Beurteilung eines solchen Zytotoxizität, ist eine gemeinsame Methodik weitgehend abhängig von Nutzung der 3 - (4, 5-Dimethyl-2-Thiazolyl) -2, 5-diphenyl-2H-Tetrazolium Bromid (MTT) bestimmt, der weithin als genutzt eine kolorimetrische Ansatz bezogen auf die Aktivität der mitochondrialen Dehydrogenase-Enzyme in den Zellen. In dieser Untersuchung wurden MCF-7-Zellen in 96-Well-Platte angeimpft und bei 50% Konfluenz wurden sie mit verschiedenen nanopolyplexes behandelt und dem Test nach 24 Stunden MTT. Wasserlösliche gelben MTT wird durch die metabolisch aktive Zellen, die in Wasser unlöslichen violetten Formazan, die weiter in Dimethylsulfoxid und Sornson s-Puffer pH 10,5 gelöst metabolisiert. Das resultierende Produkt kann durch Spektrophotometrie mit einem Platten-Lesegerät bei 570 nm quantifiziert werden.

Protokoll

MCF-7 Aussaat in 96-Well-Platte:

MCF-7-Zellen wurden in 25 t-Kolben auf ein Medium mit Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), 10% FBS, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin bei 37 ° C mit 5% CO _2, 95% Luft und Feuchtigkeit abgeschlossen. Einmal erreicht ~ 90% Konfluenz wurden sie getrennt mit 0,05% Trypsin / EDTA und gezählt mittels Trypanblau und Zählkammer. Diese Zellen wurden dann in einer Konzentration von 4 × 10 ⁴ Zellen / cm ² resuspendiert und auf 96-Well-Platte (dh 250 ul / well) von einem 8-Kanal-Pipette. Für Untergrundabsorption wurden einige Brunnen blieb zellfreien, dh als leere Kontrolle.

Die Behandlung von Zellen mit unterschiedlichen nanopolyplexes:

Bei 40-50% Konfluenz (48 Stunden nach der Aussaat) wurden die kultivierten Zellen mit nanostrukturierten starburst Polyamidoamin Dendrimere (dh Superfect ® und Polyfect ®) und ein neuer Test in Polymer nach der Transfektion Anweisung vom Lieferanten zur Verfügung gestellt behandelt. Die Zellen wurden auch mit EGFR behandelt und verschlüsselt antisense allein, und mit den drei verschiedenen nanopolyplexes dieser beiden Oligonukleotide und mit Polymeren (n = 4). Vier Brunnen wurden blieben als Kontrolle unbehandelt. Nach 4 Stunden der Behandlung Medien wurden entfernt und mit frischem Medien.

MTT-Assay für die Bewertung die Lebensfähigkeit der Zellen:

MTT-Assay wurde 24 Stunden nach der Transfektion durchgeführt. Zu diesem Zweck wurde MTT-Lösung bei 1mg/ml in PBS hergestellt und durch einen 0,2 um Filter filtriert. Dann wurden 50 ul MTT plus 200 ul DMEM ohne Phenolrot in jede Vertiefung gegeben, mit Ausnahme der zellfreien leeren Brunnen. Die Zellen wurden für 4 Stunden bei 37 ° C mit 5% CO _2, 95% Luft und vollständige Luftfeuchtigkeit. Nach 4 Stunden wurde der MTT-Lösung entfernt und ersetzt mit 200 ul DMSO und 25 &mgr; l Sorenson Glycin-Puffer (0,1 M Glycin, NaCl 0,1 M, pH: 10,5 mit 0,1 NaOH). Die Platte wurde für weitere 5 min bei Raumtemperatur inkubiert und die optische Dichte (OD) der Brunnen wurde mit einem Platten-Lesegerät bei einem Test Wellenlänge von 570 nm und einer Referenz-Wellenlänge von 630 nm.

Diskussion

Der MTT-Test gilt als eine vielseitige Methode werden und dementsprechend die Lebensfähigkeit der Zellen könnte auf verschiedene Behandlungen ausgewertet werden. Die Produktion von resultierende Formazan zu sein scheint proportional zum Füllstand des Energiestoffwechsels in den Zellen. Daher ist es möglich, die metabolisch aktivierten Zellen auch in Abwesenheit der Zellproliferation zu messen. Die Höhe der Formazan ist proportional zur Höhe des MTT in das Inkubationsmedium. Während produzierte die Konzentration v...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 t-flask	Orange Scientific	5510100
PBS	Sigma-Aldrich	P3813
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	D5671
MTT	Sigma-Aldrich	M2128
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Penicillin 200,000 u/ml	CinnaGen	CR7913
Streptomycin 200 mg/ml	CinnaGen	CR7912
trypsin/EDTA	Sigma-Aldrich	T3924
trypan blue	Sigma-Aldrich	T8154
Superfect	Qiagen	301105
Polyfect	Qiagen	301305
EGFR antisense	Eurofins MWG Operon
Scrambled antisense	Eurofins MWG Operon
DMEM without phenol red	GIBCO, by Life Technologies	11880
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898
hemocytometer	HBG
8-channel pipette	TreffLab Transferpette	96.9918.10.1
Disposable syringe filter	Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.	2052-025
Plate reader equipped with 570 nm &630 nm filters	BioTek	ELX808
96-well plate with lid (flat bottom)	Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.	3860-096
Laminar flow hood	Esco Products
CO2 Incubator	ASTEC