Toxicidade celular de Nanogenomedicine em MCF-7 Linhagem Celular: MTT

Resumo

O MTT é um ensaio simples e reprodutível colorimétrico para avaliação de viabilidade celular com base na redução do MTT amarelo e produção de formazan insolúvel em água roxa. Aqui, a viabilidade de células MCF-7 sobre o tratamento de nanogenomedicine foi avaliada.

Resumo

Citotoxicidade da nanogenomedicine futurista (eg, curtas de RNA interferente e antisense) pode prejudicar o seu desenvolvimento clínico. Desses, o medicamento baseadas em genes e / ou seu portador pode provocar toxicidade celular. Para avaliação de citotoxicidade, uma metodologia comum é em grande parte dependente de utilização de 3 - (4, 5-dimetil-2-tiazolil) -2, 5-difenil-2H-tetrazolium brometo de ensaio (MTT), que tem sido amplamente utilizado como uma abordagem colorimétrico baseado na atividade das enzimas desidrogenase mitocondrial nas células. Na presente investigação, MCF-7 foram inoculadas em células de 96 poços da placa e em 50% confluência foram tratados com nanopolyplexes diferentes e submetidos a ensaio de MTT após 24 horas. MTT solúvel em água amarela é metabolizado pelas células metabolicamente ativas para o formazan insolúvel em água roxa, que é mais dissolvido em dimetilsulfóxido pH e Sornson s tampão 10.5. O produto resultante pode ser quantificado por espectrofotometria utilizando um leitor de placas a 570 nm.

Protocolo

MCF-7 semeadura em 96 poços da placa:

MCF-7 células foram cultivadas em 25 t frasco em meio contendo Médio Modified Dulbecco Águia (DMEM), 10% FBS, 100 U / ml de penicilina e 100 estreptomicina mcg / ml a 37 ° C com 5% de CO _2, 95% ar e umidade completa. Uma vez alcançada a 90% confluência, eles foram destacados utilizando 0,05% de tripsina / EDTA e contadas por meio de azul de tripano e hemocitômetro. Essas células foram então ressuspendidas a uma concentração de 4 × 10 ⁴ células / cm ² e depois acrescentada a placa de 96 poços (ou seja, 250 mL / poço) por uma pipeta de 8 canais. Para a absorção de fundo, alguns poços foram permaneceu livre de células, ou seja, como controle em branco.

Tratamento de células com nanopolyplexes diferentes:

Na confluência de 40-50% (48 horas após a semeadura), as células cultivadas foram tratadas com dendrímeros starburst nanoestruturados poliamidoamina (ie, Superfect ® e Polyfect ®) e um polímero novo teste seguindo as instruções fornecidas pelo fornecedor de transfecção. Células também foram tratados com EGFR e mexidos antisense sozinho, e com os três nanopolyplexes diferentes destes dois oligonucleotídeos e com polímeros (n = 4). Quatro poços foram permaneceram sem tratamento como controle. Após 4 horas de tratamento da mídia foram removidos e repostos com a mídia fresco.

MTT ensaio para avaliar a viabilidade das células:

MTT foi realizada 24 horas após transfecção. Para este fim, a solução de MTT foi preparado em 1mg/ml em PBS e foi filtrado por um filtro de 0,2 mm. Então, 50 ul de MTT mais 200 mL de DMEM sem vermelho de fenol foram adicionados em cada poço, com exceção dos poços sem células em branco. Células foram incubadas durante 4 horas a 37 ° C com 5% de CO _2, 95% de ar e umidade completa. Após 4 horas, a solução MTT foi removido e substituído com 200 mL de DMSO e 25μl de Sorenson tampão glicina (glicina 0,1 M, NaCl 0,1 M, pH: 10,5 com 0,1 NaOH). A placa foi novamente incubada por 5 min à temperatura ambiente, ea densidade óptica (DO) dos poços foi determinada utilizando um leitor de placas em um teste de comprimento de onda de 570 nm e um comprimento de onda de referência de 630 nm.

Discussão

O ensaio de MTT é considerado um método versátil e, consequentemente, a viabilidade das células poderia ser avaliada após vários tratamentos. A produção de formazan resultante parece ser proporcional ao nível do metabolismo energético nas células. Portanto, é possível medir as células metabolicamente ativados, mesmo na ausência de proliferação celular. A quantidade de formazan produzido é proporcional à quantidade de MTT no meio de incubação. Enquanto, a concentração de MTT que é necessário para...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 t-flask	Orange Scientific	5510100
PBS	Sigma-Aldrich	P3813
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	D5671
MTT	Sigma-Aldrich	M2128
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Penicillin 200,000 u/ml	CinnaGen	CR7913
Streptomycin 200 mg/ml	CinnaGen	CR7912
trypsin/EDTA	Sigma-Aldrich	T3924
trypan blue	Sigma-Aldrich	T8154
Superfect	Qiagen	301105
Polyfect	Qiagen	301305
EGFR antisense	Eurofins MWG Operon
Scrambled antisense	Eurofins MWG Operon
DMEM without phenol red	GIBCO, by Life Technologies	11880
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898
hemocytometer	HBG
8-channel pipette	TreffLab Transferpette	96.9918.10.1
Disposable syringe filter	Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.	2052-025
Plate reader equipped with 570 nm &630 nm filters	BioTek	ELX808
96-well plate with lid (flat bottom)	Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.	3860-096
Laminar flow hood	Esco Products
CO2 Incubator	ASTEC