MCF-7 Hücre Line Nanogenomedicine Hücresel Toksisite: MTT assay

Özet

MTT testi sarı MTT azaltılması ve suda çözünmeyen mor formazan üretimine dayalı hücre canlılığının değerlendirilmesi için kolay ve tekrarlanabilir kolorimetrik assay. Burada, nanogenomedicine tedavi üzerine MCF-7 hücre canlılığı değerlendirildi.

Özet

Fütüristik nanogenomedicine (örneğin, kısa müdahale RNA ve antisens) Sitotoksisite klinik geliştirme engel olabilir. Bunlardan, gen bazlı ilaç ve / veya taşıyıcı hücresel toksisite ortaya çıkarmak. Gibi sitotoksisite değerlendirilmesi için ortak bir metodoloji, 3 kullanımı üzerine büyük ölçüde bağlıdır (4, 5-dimetil-2-thiazolyl) -2, yaygın olarak kullanılan 5-difenil-2H-tetrazolium bromide (MTT) tayini hücrelerinde mitokondriyal dehidrogenaz enzimlerin aktivitesi üzerine dayalı bir kolorimetrik yaklaşım. Bu araştırmada, MCF-7 hücreleri 96-plaka ekildi ve 50% confluency farklı nanopolyplexes ile tedavi edildi ve 24 saat sonra tahlil MTT için tabi. Suda çözünen sarı MTT dimethylsülfoksit ve Sornson s tampon pH 10,5 daha fazla çözünmüş suda çözünmeyen mor formazan, metabolik olarak aktif hücreler tarafından metabolize edilir. Ortaya çıkan ürün, 570 nm'de bir plaka okuyucu kullanarak spektrofotometri tarafından belirlenebilir.

Protokol

MCF-7 96-plaka tohumlama:

MCF-7 hücreleri 37 ° Dulbecco'nun Modifiye Kartal Kullanıcı Orta (DMEM),% 10 FBS, 100 U / ml penisilin, ve 100 mg / ml streptomisin içeren orta 25 t-balon kültüre edildi ° C'de% 5 CO _2,% 95 ile hava ve tam nem. Bir kez ~% 90 confluency ulaştı, 0.05% tripsin / EDTA ile müstakil ve tripan mavi ve hemasitometre sayılır. Bu hücreler daha sonra 4 × 10 ⁴ hücre / cm ² 'lik bir konsantrasyon yeniden bekletildi ve 8 kanallı pipet tarafından (yani, 250 ul / kuyu) 96 plaka üzerine eklendi. Arka plan emilimi için bazı kuyuların boş kontrol olarak hücre, yani kaldı.

Farklı nanopolyplexes ile hücreler Tedavisi:

% 40-50 az confluency (48 saat tohumlama), kültür hücreleri nanoyapılı dolup taşan polyamidoamine dendrimers (yani, Superfect ® ve Polyfect ®) ve tedarikçi tarafından sağlanan transfeksiyon talimat aşağıdaki bir roman test polimer ile tedavi edildi. Hücreler aynı zamanda EGFR tedavi ve yalnız antisens şifreli ve bu iki oligonükleotidler üç farklı nanopolyplexes ve polimerler (n = 4) idi. Dört kuyuların kontrolü gibi tedavi edilmezse kaldı. 4 saat sonra tedavi medya çıkarıldı ve taze medya ile doldurulmaktadır.

Hücre canlılığını değerlendirmek için MTT assay:

MTT assay transfeksiyon 24 saat sonra yapıldı. Bu amaçla, MTT çözüm PBS içinde 1mg/ml hazırlanan ve 0,2 mikron filtre ile filtre edilmiştir. Sonra, MTT artı fenol kırmızısı olmadan DMEM 200 ul ul 50 hücre boş kuyular hariç, her bir kuyunun içine ilave edildi. Hücreler 37 az 4 saat süreyle inkübe edildi ° C,% 5 CO _2,% 95 hava ve nem tam. 4 saat sonra, MTT çözüm kaldırılır ve DMSO ve 25μl Sorenson glisin tamponu (glisin 0.1M NaCl 0.1M, pH: 10.5 0.1 NaOH ile) 200 ul ile değiştirilir. Plaka daha fazla oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edildi ve kuyuların optik yoğunluk (OD), 570 nm test dalga boyu ve 630 nm referans dalga boyu bir plaka okuyucu kullanılarak tespit edildi.

Tartışmalar

MTT testi, çok yönlü bir yöntem olarak kabul edilir ve buna göre çeşitli tedaviler üzerine hücrelerin canlılığı değerlendirilebilir. Sonuç formazan üretimi, hücrelerde enerji metabolizması düzeyi ile orantılı olarak görünür. Bu nedenle, metabolik olarak aktif hücrelerin hücre proliferasyonu yokluğunda bile ölçmek mümkündür. Üretilen formazan miktarı inkübasyon orta MTT miktarı ile doğru orantılıdır. Ederken, formazan maksimum miktarını elde etmek için gerekli olan MTT konsantra...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 t-flask	Orange Scientific	5510100
PBS	Sigma-Aldrich	P3813
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	D5671
MTT	Sigma-Aldrich	M2128
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Penicillin 200,000 u/ml	CinnaGen	CR7913
Streptomycin 200 mg/ml	CinnaGen	CR7912
trypsin/EDTA	Sigma-Aldrich	T3924
trypan blue	Sigma-Aldrich	T8154
Superfect	Qiagen	301105
Polyfect	Qiagen	301305
EGFR antisense	Eurofins MWG Operon
Scrambled antisense	Eurofins MWG Operon
DMEM without phenol red	GIBCO, by Life Technologies	11880
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898
hemocytometer	HBG
8-channel pipette	TreffLab Transferpette	96.9918.10.1
Disposable syringe filter	Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.	2052-025
Plate reader equipped with 570 nm &630 nm filters	BioTek	ELX808
96-well plate with lid (flat bottom)	Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.	3860-096
Laminar flow hood	Esco Products
CO2 Incubator	ASTEC