Toxicité cellulaire des Nanogenomedicine dans la lignée cellulaire MCF-7: test MTT

Résumé

Le test MTT est un test simple et reproductible colorimétriques pour l'évaluation de la viabilité cellulaire basé sur la réduction du MTT jaune et la production d'eau formazan violet insoluble. Ici, la viabilité des cellules MCF-7 sur le traitement des nanogenomedicine a été évalué.

Résumé

La cytotoxicité de l'nanogenomedicine futuristes (par exemple, petits ARN interférents et antisens) peuvent entraver son développement clinique. Parmi ces derniers, la médecine fondée sur les gènes et / ou son transporteur peut susciter une toxicité cellulaire. Pour l'évaluation de la cytotoxicité telle, une méthodologie commune est largement tributaire de l'utilisation de la 3 - (4, 5-diméthyl-2-thiazolyl) -2, 5-diphényl-2H-tétrazolium (MTT) qui a été largement utilisé comme une approche colorimétrique basé sur l'activité des enzymes déshydrogénases mitochondriales dans les cellules. Dans cette enquête, cellules MCF-7 ont été inoculés dans plaque de 96 puits et à 50% de confluence, ils ont été traités avec nanopolyplexes différents et soumis à des test MTT après 24 heures. Eau MTT solubles jaune est métabolisé par les cellules métaboliquement actives pour le formazan violet insoluble dans l'eau, qui est encore dissous dans du tampon pH diméthylsulfoxyde et Sornson s 10.5. Le produit résultant peut être quantifiée par spectrophotométrie en utilisant un lecteur de plaque à 570 nm.

Protocole

MCF-7 semis en plaque de 96 puits:

Cellules MCF-7 ont été cultivées dans 25 t-ballon dans un milieu contenant Medium Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), 10% de FBS, 100 U / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine à 37 ° C avec 5% de CO _2, 95% air et l'humidité complète. Une fois atteint ~ 90% de confluence, ils ont été détachés en utilisant 0,05% de trypsine / EDTA et comptées par les moyens de bleu trypan et hémocytomètre. Ces cellules ont ensuite été remises en suspension à une concentration de 4 x 10 ⁴ cellules / cm ² et ajouté sur plaque de 96 puits (ie, 250 ul / puits) par une pipette à 8 canaux. Pour l'absorption de fond, certains puits ont été resté sans cellule, c'est à dire que le contrôle vierge.

Traitement des cellules avec nanopolyplexes différentes:

À 40-50% de confluence (48 heures après l'ensemencement), les cellules cultivées ont été traités avec nanostructurés dendrimères polyamidoamine Starburst (ie, Superfect ® et Polyfect ®) et un polymère nouveau test en suivant les instructions fournies par le fournisseur de transfection. Les cellules ont été également traités avec EGFR et brouillés antisens seul, et avec les trois nanopolyplexes différente de ces deux oligonucléotides et par des polymères (n = 4). Quatre puits ont été n'ont pas été traités comme contrôle. Après 4 heures du traitement médiatique ont été enlevés et reconstituées avec des milieux frais.

MTT pour l'évaluation de la viabilité cellulaire:

MTT a été réalisée 24 heures après transfection. Pour ce faire, la solution de MTT a été préparé à 1mg/ml dans du PBS et a été filtré à travers un filtre de 0,2 um. Ensuite, 50 ul de MTT et 200 ul de DMEM sans rouge de phénol ont été ajoutés dans chaque puits, à l'exception des puits sans cellules vides. Les cellules ont été incubées pendant 4 heures à 37 ° C avec 5% de CO _2, 95% d'air et d'humidité complète. Après 4 heures, la solution de MTT a été enlevé et remplacé par 200 ul de DMSO et 25 pi de Sorenson tampon glycine (glycine 0,1 M, NaCl 0,1 M, pH: 10,5 à 0,1 NaOH). La plaque a été incubée pendant encore 5 min à température ambiante, et la densité optique (DO) des puits a été déterminée en utilisant un lecteur de plaque à une longueur d'onde de test de 570 nm et une longueur d'onde de référence de 630 nm.

Discussion

Le test MTT est réputé être une méthode souple et donc la viabilité des cellules peut être évaluée sur divers traitements. La production de formazan résultante semble être proportionnelle au niveau du métabolisme énergétique des cellules. Par conséquent, il est possible de mesurer les cellules métaboliquement actives même en l'absence de prolifération cellulaire. La quantité de formazan produite est proportionnelle à la quantité de MTT dans le milieu d'incubation. Alors, la concentration de M...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 t-flask	Orange Scientific	5510100
PBS	Sigma-Aldrich	P3813
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	D5671
MTT	Sigma-Aldrich	M2128
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Penicillin 200,000 u/ml	CinnaGen	CR7913
Streptomycin 200 mg/ml	CinnaGen	CR7912
trypsin/EDTA	Sigma-Aldrich	T3924
trypan blue	Sigma-Aldrich	T8154
Superfect	Qiagen	301105
Polyfect	Qiagen	301305
EGFR antisense	Eurofins MWG Operon
Scrambled antisense	Eurofins MWG Operon
DMEM without phenol red	GIBCO, by Life Technologies	11880
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898
hemocytometer	HBG
8-channel pipette	TreffLab Transferpette	96.9918.10.1
Disposable syringe filter	Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.	2052-025
Plate reader equipped with 570 nm &630 nm filters	BioTek	ELX808
96-well plate with lid (flat bottom)	Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.	3860-096
Laminar flow hood	Esco Products
CO2 Incubator	ASTEC