Nanogenomedicine在MCF - 7细胞的细胞毒性：MTT法

摘要

MTT法是一种简便，重现性好比色法测定细胞活力评价的基础上减少黄色的MTT和不溶于水，紫色的甲臜的生产。在这里，nanogenomedicine治疗后，MCF - 7细胞的可行性进行了评估。

摘要

未来派nanogenomedicine（例如，短干扰RNA和反义）的细胞毒性，可能妨碍其临床发展。这些基因为基础的医药和/或它的载体可能会引起细胞毒性。对于评估等的细胞毒作用，常见的方法是在很大程度上依赖利用3 - （4,5 - 二甲基-2 - 噻唑基）-2，5 - 二苯基- 2H -四氮唑溴（MTT）法已被广泛用作比色的方法，在细胞线粒体脱氢酶的酶的活性的基础上。在当前的调查，MCF - 7细胞接种在96孔板和50％汇合，他们与不同的nanopolyplexes对待，并受到24小时后，以MTT法检测。水溶性的黄色的MTT代谢的代谢活跃的细胞，不溶于水的紫色的甲臜，这是进一步溶解在二甲基亚砜和Sornson的缓冲区pH值10.5。由此产生的产品是可以量化的使用酶标仪在570 nm处一个分光。

研究方案

MCF - 7播种在96孔板：

MCF - 7细胞分别培养在25吨的烧瓶中包含在37贝科的修改鹰的中等（DMEM），10％胎牛血清，100单位/毫升青霉素，和100微克/毫升链霉素中等°彗星与5％的CO _2，95％空气和完整的湿度。一旦达到〜90％汇合，他们分离用0.05％胰蛋白酶/ EDTA，并通过台盼蓝和血球计数。这些细胞，然后悬浮在浓度为4 × 10 ⁴细胞/厘米^2，补充到96孔板，8道移液器（即250μL/） 。背景吸收，一些井依然无细胞，即作为空白对照。

治疗不同nanopolyplexes的细胞：

在40-50％汇合（48小时后播种），培养细胞治疗的纳米爆聚酰胺树枝状（即Superfect ®和Polyfect ®）和一种新型的测试聚合物后，转由供应商提供的指令。细胞也与表皮生长因子受体治疗和反义单独炒，并与这两个寡核苷酸的三个不同nanopolyplexes的聚合物（N = 4）。四口井仍然控制未经处理的。经过4个小时的治疗媒体被拆除，并与新媒体的补充。

MTT法检测细胞活力评价：

MTT法检测转染后24小时。为此，MTT溶液在PBS 1mg/ml的准备，并通过0.2微米的过滤器过滤。然后，每孔加入50μL的MTT加200μL无酚红的DMEM，无细胞的空白孔除外。细胞孵育4小时，在_{37℃，5％CO 2，95％}的空气湿度和完整。 4小时后，MTT溶液和200μLDMSO和25μlSorenson的甘氨酸缓冲液（0.1M，0.1M的氯化钠，甘氨酸0.1氢氧化钠的pH值：10.5）所取代。板在室温下5分钟，继续培养和使用酶标仪在570 nm处的测试波长和参考波长630纳米一个井光密度（OD值）测定。

讨论

MTT法被认为是一个通用的方法，可以根据各种治疗方法的评估和相应的细胞的可行性。由此产生的甲臜的生产似乎是在细胞能量代谢水平成正比。因此，它是可能的措施，甚至在细胞增殖的情况下的代谢活性的细胞。产生的甲臜量在孵化介质的MTT量是成正比的。虽然，这是要求达到最高金额的甲臜的MTT浓度产生的可能发生变化后，利用不同的细胞系。此外，使用这种检测，可以检测到非常小的活...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 t-flask	Orange Scientific	5510100
PBS	Sigma-Aldrich	P3813
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	D5671
MTT	Sigma-Aldrich	M2128
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Penicillin 200,000 u/ml	CinnaGen	CR7913
Streptomycin 200 mg/ml	CinnaGen	CR7912
trypsin/EDTA	Sigma-Aldrich	T3924
trypan blue	Sigma-Aldrich	T8154
Superfect	Qiagen	301105
Polyfect	Qiagen	301305
EGFR antisense	Eurofins MWG Operon
Scrambled antisense	Eurofins MWG Operon
DMEM without phenol red	GIBCO, by Life Technologies	11880
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898
hemocytometer	HBG
8-channel pipette	TreffLab Transferpette	96.9918.10.1
Disposable syringe filter	Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.	2052-025
Plate reader equipped with 570 nm &630 nm filters	BioTek	ELX808
96-well plate with lid (flat bottom)	Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.	3860-096
Laminar flow hood	Esco Products
CO2 Incubator	ASTEC