Aislamiento del ARN de síntesis embrionarias pez cebra y el cDNA de análisis de expresión génica

Resumen

El aislamiento de alta calidad, intacta ARN es un paso esencial en los protocolos de laboratorio de muchos. Este sentido, demuestran la extracción de RNA a partir de embriones de pez cebra conjunto y la síntesis de ADNc para su posterior aplicación en diversos procedimientos experimentales, incluyendo el análisis de microarrays de expresión génica.

Resumen

Muchos procedimientos de laboratorio importantes y complejas requieren una entrada de alta calidad, el ARN intacto. Una muestra degradada o la presencia de impurezas puede llevar a resultados desastrosos en posteriores aplicaciones experimentales. Por lo tanto, de suma importancia el uso de técnicas sólidas con numerosas salvaguardias y controles de calidad para asegurar una muestra superior. Aquí, los detalles de un protocolo para aislar el ARN total a partir de embriones de pez cebra con todo un desnaturalizante químico disponible en el mercado y la limpieza posterior para eliminar los rastros de ADN y las impurezas mediante un kit comercial de aislamiento de ARN. Como el ARN es relativamente inestable y fácilmente propensa a la ruptura por RNAsas, la mayoría de los protocolos de ensayo de expresión génica utilizando un producto de cDNA que está directamente sintetizado a partir de una plantilla de ARN. Se detalla un procedimiento para convertir el ARN en el producto más estable cDNA utilizando un kit disponible comercialmente. A lo largo de estos procedimientos existen numerosos controles de calidad para asegurar que la muestra no es degradadas o contaminadas. El producto final de estos protocolos es cDNA que es adecuado para el análisis de microarrays, RT-PCR o el almacenamiento a largo plazo.

Protocolo

Parte 1: Extracción de ARN total utilizando el reactivo TRIzol

Cuando se trabaja con el ARN es muy importante para trabajar en un ambiente libre de RNAsas. Precauciones simples como tener pipetas reservados para uso exclusivo con los procedimientos de ARN y la pulverización de la zona de trabajo con un reactivo descontaminante (por ejemplo, RNAsa Away) antes de iniciar el procedimiento es muy útil.

1. Para lograr una suficiente cantidad de ARN de embriones de pez cebra piscina de 50 en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y eliminar la mayor cantidad de agua posible con una pipeta.
2. Inmediatamente añadir 250 l de reactivo TRIzol ¹ al tubo de microcentrífuga que contiene los embriones. TRIzol reactivo contiene fenol y sólo debe utilizarse bajo una campana de humos.
3. Lisis y homogeneizar los embriones con una mano de pellet (aproximadamente 20 golpes) hasta que el tejido es suficientemente perturbado.
4. Cuando las células son lo suficientemente homogeneizado, añadir 750 l de reactivo TRIzol igual a un volumen total de 1 ml.
5. Para permitir la disociación completa de los complejos de nucleoproteína, incubar muestras homogeneizadas durante 5 minutos a temperatura ambiente. En esta etapa, la muestra puede ser flash congelado en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C o el protocolo se puede continuar.
6. Para continuar añadir 0,2 ml de cloroformo y oscilar el tubo durante 15 segundos para mezclar.
7. Incubar la muestra durante 2 minutos a temperatura ambiente y centrifugar a 12.000 xg durante 15 minutos a 4 ° C.
8. La mezcla se separará en una menor rojo de fenol-cloroformo fase, una interfase, y un descolorido fase acuosa superior. La fase acuosa superior contiene el ARN. La capa superior debe formar parte de alrededor del 60% del volumen inicial de TRIzol (aproximadamente 0,6 ml). La transferencia de la capa acuosa superior a un tubo de microcentrífuga nuevo utilizando una pipeta de 1 ml con cuidado de no transferir ninguna de la capa de interfase.
9. Para precipitar el ARN añadir 0,5 ml de isopropanol.
10. Dejar que la muestra llegue a temperatura ambiente durante 10 minutos y centrifugar la muestra a 12.000 xg durante 10 minutos a 4 ° C. ARN se forma una bolita de gel en la parte inferior del tubo.
11. Sin perturbar el sedimento, separar el sobrenadante con una pipeta y se lava el precipitado en 1 ml de etanol al 75%. Mezclar la muestra por inversión suave y centrifugar a 7500 xg durante 5 minutos a 4 ° C.
12. Después de la centrifugación, separar el etanol con una pipeta y que la muestra se seque mientras está invertido durante 10 minutos.
13. Resuspender el pellet añadiendo 100 l de RNasa libre de agua e incubar la muestra a 55 ° C durante 10 minutos. Se recomienda a los dedos del vórtice con frecuencia durante la incubación para ayudar en la rehidratación de ARN. Si lo desea, puede comprobar la calidad y cantidad de la muestra con un ND-1000 espectrofotómetro NanoDrop o directamente pasar a la siguiente etapa.

Parte 2: El ARN de limpieza utilizando el Qiagen RNeasy Mini Kit

El Qiagen RNeasy Mini Kit ² es útil en la eliminación de los contaminantes y las impurezas de una muestra de ARN aislado de otros métodos. Para este procedimiento, β-mercaptoetanol, el etanol y el agua libre de nucleasa se necesitan, además de los componentes incluidos en el kit. Una opción de tratamiento con ADNasa se recomienda durante este procedimiento.

1. Tras el primer uso del kit, Buffer RPE deberán ser preparados por la adición de 4 volúmenes de etanol al 100% para un volumen de buffer RPE.
2. En el día del procedimiento, el tampón RLT tendrá que estar preparado fresco. Calcular la cantidad total de RLT buffer que se necesitarán. Un volumen de 350 l que se necesita por muestra. Para preparar el tampón RLT, añadir 10 l de β-mercaptoetanol por cada 1 ml de solución tampón. Esto debe hacerse bajo la campana de humos.
3. Para cada muestra se añaden 350 l de tampón RLT y 250 l de etanol al 100%. Mezclar bien con la pipeta hacia arriba y abajo varias veces.
4. Transferir la muestra, que debe ser de aproximadamente 700 l, en una columna RNeasy que se coloca en un tubo de recogida de 2 ml y centrifugar a 8000 xg durante 1 minuto a temperatura ambiente.
5. Después de centrifugar, descartar el flujo a través y añadir 700 l de tampón RW1 a una columna de giro RNeasy.
6. Centrifugar la muestra a 8.000 xg durante 1 minuto a temperatura ambiente y luego descartar el flujo a través.
7. Tratamiento con DNAsa Qiagen Kit RNasa libre de DNasa: DNAsa tratamiento es opcional, pero es muy recomendable para las muestras de la más alta calidad.
   1. Al recibir el kit de tratamiento de DNAsa, tendrá que preparar la solución de DNAsa I de valores mediante la adición de 550 l de nucleasa libre de agua a la DNAsa. Mezclar suavemente por inversión y no del vórtice. Alícuotas en viales de un solo uso con 10 l de la solución madre. Puede almacenar la solución madre a -20 ° C durante un máximo de 9 meses. Las alícuotas descongeladas se pueden almacenar a 4 ° C durante 6 semanas si es necesario, pero no volver a congelar las alícuotas después de la descongelación.
   2. Para preparar la mezcla de DNasa I incubación añadir 70 l de búfer DDR a 10 l s DNAsa Itac solución por muestra. Mezclar por inversión suave y tubo de centrífuga brevemente para recoger el líquido residual de los lados del tubo. Añadir 80 l DNAsa mezcla de incubación que directamente a la columna de centrifugación RNeasy. Incubar el tratamiento DNAsa durante 30 minutos a temperatura ambiente.
8. Después del tratamiento con DNAsa añadir 350 l RW1 Buffer a la columna de centrifugación y centrifugar a 8000 xg durante 1 minuto a temperatura ambiente.
9. Después de la centrifugación descartar el flujo a través de RPE y añadir 500 l de búfer en la columna de giro. Incubar la muestra durante 5 minutos a temperatura ambiente.
10. Centrifugar la muestra a 8.000 xg durante 1 minuto a temperatura ambiente y desechar el flujo a través.
11. Después de la centrifugación añadir 500 l de etanol al 75% en la columna de giro.
12. Repetir la centrifugación a 8.000 xg, pero durante 2 minutos a temperatura ambiente.
13. Después de la centrifugación descartar el flujo a través de la columna y permitir que se seque durante 5 minutos.
14. Inmediatamente se centrifuga a 8000 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente para eliminar a la izquierda sobre los rastros de etanol.
15. Después de la centrifugación es la transferencia completa de la columna de centrifugación en un nuevo tubo de 1.5 ml de recogida y se añaden 10 l agua libre de nucleasa. Incubar durante 1 minuto y centrifugar a 10.000 xg durante 1 minuto a temperatura ambiente. El ARN estará en el flujo a través.
16. Añadir otro l 10 de agua libre de nucleasa a la columna de centrifugación y se incuban a temperatura ambiente durante 1 minuto. Centrifugar la muestra a 10.000 xg durante 1 minuto a temperatura ambiente.
17. Después de la centrifugación retirar y desechar la columna de giro. ARN estará en el flujo a través.
18. Comprobar la cantidad y calidad del ARN utilizando un NanoDrop ND-1000 espectrofotómetro siguiendo las instrucciones del fabricante.
19. Además, corre un gel de desnaturalización o de utilizar un Agilent 2100 Bioanalyzer para comprobar la integridad del ARN.
20. Las muestras deben ser almacenadas a -80 ° C hasta que la síntesis de ADNc se puede realizar.

Parte 3: Síntesis de cDNA utilizando la Invitrogen superíndice primer capítulo del Sistema

El ARN es fácilmente propensa a la ruptura por RNAsas que conduce a la degradación. Como resultado, muchos protocolos de expresión de los genes se han desarrollado para utilizar un producto de cDNA más estable que ha sido directamente sintetiza a partir del ARN. Aquí detallamos la síntesis de cDNA primer capítulo con la Invitrogen superíndice primer capítulo de síntesis del sistema ^tres. Cada reacción de síntesis de cDNA con capacidad para 5 g de ARN.

1. Antes de iniciar el procedimiento de mezcla y centrifuga brevemente cada componente.
2. Prepare ARN / mezcla de imprimación en un tubo de microcentrífuga estéril 0,5 ml como se indica en la Tabla 1.
3. Incubar la muestra a 65 ° C durante 5 minutos.
4. Inmediatamente la transferencia de muestras de suspensión de hielo durante 10 minutos.
5. Mientras que la muestra se enfría preparar una mezcla maestra con los componentes descritos en la Tabla 2. Los volúmenes están indicadas por una reacción. Ajustar los volúmenes de acuerdo con el número total de reacciones.
6. Después de enfriar, añadir 9 l de la mezcla maestra preparada en el paso 5 para cada ARN / mezcla de imprimación. Mezclar suavemente y recoger por centrifugación breve. El volumen total de cada muestra debe ser de 19 l.
7. Incubar la muestra a 42 ° C durante 2 minutos en un termociclador.
8. Añadir 1 l (50 unidades) de superíndice II RT a cada tubo, mezclar e incubar a 42 ° C durante 60 minutos en un termociclador.
9. Terminar la reacción a 70 ° C durante 15 minutos y luego se muestra frío a 4 ° C. Un termociclador puede ser programado para los pasos 8 y 9.
10. Después de la muestra ha llegado a 4 ° C, la transferencia de la reacción a un baño de hielo.
11. En el hielo añadir 1 l de RNasa H a cada tubo y se incuba durante 20 minutos a 37 ° C. El volumen total es ahora de 21 microlitros. Además de RNasa H en la muestra se degrada el ARN molde y dejar sólo el producto de cDNA único.

Parte 4: Aislamiento de ADNc y precipitación

1. A 1,5 ml de la fase de bloqueo del tubo de gel se utiliza en el aislamiento del producto de cDNA. Preparar un 1,5 ml de fase de bloqueo del tubo de gel mediante centrifugación a 12.000 xg durante 2 minutos. El gel debe ser todo en la parte inferior del tubo.
2. Añadir 81,5 l de fenol (Tris-saturadas, tamponada a pH 8,0), 81,5 l de cloroformo alcohol isoamílico 24:1, y la muestra (21 l) en el tubo de gel de fase de bloqueo. Mezcla varias veces por inversión suave.
3. Centrifugar la muestra a 12.000 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente.
4. El cDNA debe estar en la fase acuosa superior. Transferir la fase superior a un tubo de microcentrífuga limpio de 1.5 ml. El volumen total debe ser de alrededor de 20 microlitros.
5. Añadir 1X volumen de 3 M NaOAc, pH 5,2 y mezclar suavemente. Por ejemplo, si el volumen de la fase acuosa superior era igual a 20 l, tendrá que añadir 2 l de 3 M NaOAc, pH 5,2.
6. Añadir 7 l de 5 mg / ml de glucógeno y mezclar suavemente.
7. Añadir 1X volumen de isopropanol y mezclar suavemente. En general, esta es de unos 30 l de isopropanol.
8. Que la muestra de incubar a temperatur ambientee durante 10 minutos y centrifugar a 12.000 xg durante 20 minutos a temperatura ambiente.
9. Una pequeña bolita de cDNA que se forman en la parte inferior del tubo. Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta.
10. Añadir 500 l de etanol al 70% y mezclar por inversión.
11. Centrifugar la muestra a 12.000 xg durante 5 minutos.
12. Después de la centrifugación separar el sobrenadante con una pipeta y repetir el lavado de etanol al 70% y centrifugación (medidas 10 y 11).
13. Después de la centrifugación separar el sobrenadante con una pipeta. Si no es el líquido residual en los lados del tubo, que puede ser recogida por una breve gira el tubo. Elimine cualquier exceso de líquido y permitir que se seque el precipitado a temperatura ambiente durante 5 minutos.
14. Añadir 20 l de agua libre de nucleasa para rehidratar la pastilla. Coloque la muestra a 55 ° C durante 5 minutos para la rehidratación de la pastilla.
15. La cantidad y la calidad del producto de cDNA se comprueba utilizando un NanoDrop ND-1000 espectrofotómetro siguiendo las instrucciones del fabricante. El cDNA se pueden almacenar a -20 ° C.

Resultados representante

Después de la limpieza de ARN, de aproximadamente 15 g de ARN de alta calidad total se puede esperar a partir de 50 embriones de pez cebra. Para evaluar la calidad total de ARN, un espectrofotómetro, electroforesis en gel, y un Bioanalyzer Agilent 2100 puede ser utilizado. ND-1000 NanoDrop espectrofotómetro se puede utilizar para evaluar la absorbancia a 260 nm en comparación con la absorbancia a 280 nm (Figura 1). El A ₂₆₀ / A ₂₈₀ puede revelar la presencia de contaminantes y dar pruebas de una posible degradación. Un ₂₆₀ / A ₂₈₀ de 1,9-2,0 se considera aceptable. Además, es altamente recomendable que un gel de desnaturalización del ARN puede ejecutar para evaluar la integridad del ARN. Cadenas de ARN se separan en función de su tamaño, con menor migración de líneas más abajo en el gel. Una muestra no degradada, aparecerá como una prueba con dos bandas muy resistentes. La citología es el resultado de una población de diferentes cadenas de ARNm de tamaño y las bandas correspondientes a 28S y 18S ARNr. La banda 28S debe ser aproximadamente el doble de intensa que la banda 18S (Figura 2). Por otra parte, el total de la integridad del ARN se puede evaluar utilizando un Agilent 2100 Bioanalyzer. Dos picos distintos que representan el rRNA 28S y 18S se espera (Figura 3). El pico 28S debe ser mayor que el 18S pico con el área bajo los picos de aproximadamente 2:1, respectivamente. Dos picos distintos, no se observó en muestras degradadas. RNA de muestras que exhiban degradación no debe ser llevado a través de posteriores procedimientos experimentales.

La prueba espectrofotométrica se puede utilizar para evaluar la calidad del producto de cDNA (Figura 4). El A ₂₆₀ / A ₂₈₀ debe estar alrededor de 1,8. reacciones cDNA con una entrada de 5 g de ARN total rutinariamente rendimiento mg 1-2 de cDNA producto en nuestro laboratorio.

Figura 1. Un espectro NanoDrop de muestra de RNA. Después de la limpieza de ARN, ARN cantidad y la calidad se puede evaluar con un ND-1000 NanoDrop espectrofotómetro. Aproximadamente 15 mg de ARN total de alta calidad de forma rutinaria dado a partir de 50 embriones de pez cebra con un A ₂₆₀ / A ₂₈₀ alrededor de 1.9-2.0.

Figura 2. Un gel de desnaturalización del ARN. Para evaluar la integridad del total aislamiento de ARN, un gel de desnaturalización del ARN se puede correr. Una prueba con dos bandas brillantes que corresponden a 28S y 18S ARNr se espera. La banda 28S debe ser aproximadamente el doble de intensa que la banda 18S.

Figura 3. Un rastro de una muestra de ARN de una bioanalizador. Para evaluar la integridad del total aislamiento de ARN, las muestras pueden ser analizadas en un Agilent 2100 Bioanalyzer. Dos picos agudos, que corresponde al 28S y 18S rRNA, debe ser visible. El pico 28S debe ser mayor que el 18S pico con el área bajo los picos de aproximadamente 2:1, respectivamente.

Figura 4. Un espectro NanoDrop de una muestra de DNA. La prueba espectrofotométrica con un NanoDrop ND-1000 se puede utilizar para evaluar la cantidad y calidad del producto de cDNA. El A ₂₆₀ / A ₂₈₀ debe estar alrededor de 1,8. reacciones cDNA con una entrada de 5 ug de RNA total rutinariamente rendimiento 1.2 ug de cDNA en nuestro laboratorio.

Tabla 1. Componentes para añadir el RNA / mezclas de imprimación en el paso 2 de la síntesis de cDNA.

Componente	Volumen
El ARN total (hasta 5 g)	10 l
10 mM dNTP mix	1 l
Oligo (dT) 12-18 (0.5 mg / l)	1 l
Agua tratada con DEPC	n l
Volumen total	10 l

Tabla 2. Mezcla de reacción para el paso 5 de la síntesis de cDNA. Los volúmenes indicados son por reacción. Aumentar los volúmenes de cada componente para el número total de reacciones.

Componente	Volumen
10X Buffer RT	2 l
25 mM MgCl2	4 l
0,1 mM DTT	2 l
RNAseOUT	1 l

Discusión

La fragilidad de la molécula de ARN es la consideración más importante que debe tenerse en cuenta a lo largo de este protocolo. Material estéril que se RNasa libre siempre debe ser utilizado en una zona de RNasa libre del laboratorio. Es de gran ayuda para reservar una parte del laboratorio que deberán utilizarse para los procedimientos de ARN solamente. Esta área debe ser rociado con frecuencia con un producto de la eliminación de RNAsa, como la RNAsa lejos. El RNA de muestras siempre deben ser manejados con gua...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycogen (5 mg/ml)	Ambion	9510
NanoDrop ND-100	Thermo Fisher Scientific, Inc.	ND-1000
Pellet Pestles with Microfuge Tube	VWR international	KT749520-0090
Phase Lock Gel Light, 1.5 ml	Eppendorf	2302800
Phenol, Tris-saturated	Roche Group	3117944001
RNAse Away	VWR international	17810-491
RNAse-Free DNase Set	Qiagen	79254
RNEasy Mini Kit	Qiagen	74104
SuperScript® First-Strand Synthesis System for RT-PCR	Invitrogen	11904-018
TRIzol	Invitrogen	15596-026