Isolement d'ARN à partir de synthèse d'ADNc embryonnaires Zebrafish et pour analyser l'expression génique

Résumé

L'isolement de haute qualité, intacte ARN est une étape essentielle dans de nombreux protocoles de laboratoire. Ici, nous démontrons l'extraction d'ARN à partir d'embryons de poisson zèbre ensemble et synthèse de l'ADNc pour l'application ultérieure dans diverses procédures expérimentales, y compris l'analyse des microréseaux d'expression génique.

Résumé

Beaucoup de procédures de laboratoire importants et complexes nécessitent une entrée de haute qualité, l'ARN intact. Un échantillon de dégradé ou de la présence d'impuretés peuvent conduire à des résultats désastreux en aval des applications expérimentales. Il est donc primordial d'utiliser des techniques solides avec de nombreuses garanties et des contrôles de qualité afin d'assurer un échantillon de qualité supérieure. Ici, nous détaillons un protocole pour isoler l'ARN total à partir d'embryons de poisson zèbre entier en utilisant un dénaturant chimiques disponibles dans le commerce et le nettoyage subséquent pour enlever les traces de l'ADN et les impuretés à l'aide d'un kit d'isolation commerciale ARN. Comme l'ARN est relativement instable et facilement sujettes au clivage par RNases, la plupart des protocoles d'expression génique dosage en utilisant un produit d'ADNc qui est directement synthétisée à partir d'une matrice d'ARN. Nous détaillons une procédure pour convertir l'ARN dans le produit plus stable d'ADNc en utilisant un kit disponible dans le commerce. Tout au long de ces procédures il ya de nombreux contrôles de qualité afin de s'assurer que l'échantillon n'est pas dégradés ou contaminés. Le produit final de ces protocoles est d'ADNc qui est approprié pour biopuces d'analyse, la RT-PCR ou stockage à long terme.

Protocole

Partie 1: Extraction des ARN totaux à l'aide du réactif Trizol

Lorsque vous travaillez avec de l'ARN, il est très important de travailler dans un environnement qui est exempt de RNases. Des précautions simples, comme avoir des pipettes réservées à un usage uniquement avec les procédures de l'ARN et la pulvérisation de la zone de travail avec un réactif décontaminant (par exemple, RNase Away) avant le début de la procédure sont très utiles.

1. Pour atteindre une quantité suffisante d'embryons de poisson zèbre pool d'ARN 50 dans un tube de 1,5 ml de microcentrifugation et retirer autant d'eau que possible avec une pipette.
2. Immédiatement ajouter 250 ul de réactif TRIzol ¹ au tube de centrifugeuse contenant les embryons. Réactif Trizol contient du phénol et ne doit être utilisée sous une hotte.
3. Lyse et homogénéiser les embryons avec un pilon à granulés (environ 20 coups) jusqu'à ce que le tissu est suffisamment perturbé.
4. Lorsque les cellules sont suffisamment homogénéisé, ajouter 750 ul réactif TRIzol pour égaler un volume total de 1 ml.
5. Afin de permettre la dissociation complète des complexes nucléoprotéiques, incuber des échantillons homogénéisés pendant 5 minutes à température ambiante. A ce stade, l'échantillon peut être éclair congelés dans l'azote liquide et conservés à -80 ° C ou le protocole peut être poursuivi.
6. Pour continuer à ajouter 0,2 ml de chloroforme et le rock le tube pendant 15 secondes pour mélanger.
7. Incuber l'échantillon pendant 2 minutes à température ambiante, puis centrifuger à 12 000 xg pendant 15 minutes à 4 ° C.
8. Le mélange va se séparer en bas d'un rouge de phénol-chloroforme phase, une interphase et une phase aqueuse supérieure incolore. La phase aqueuse supérieure contenant l'ARN. La couche supérieure doit comporter d'environ 60% du volume initial de TRIzol (environ 0,6 ml). Transfert de la couche aqueuse supérieure dans un tube de centrifugeuse nouvelle aide d'une pipette de 1 ml en faisant attention à ne pas transférer de la couche d'interphase.
9. Pour précipiter les ARN ajoutez 0,5 ml d'isopropanol.
10. Laisser l'échantillon reposer à température ambiante pendant 10 minutes, puis centrifuger l'échantillon à 12 000 xg pendant 10 minutes à 4 ° C. ARN formeront une pastille de gel-like sur le fond du tube.
11. Sans perturber le culot, éliminer le surnageant avec une pipette et laver le culot dans 1 ml d'éthanol à 75%. Mélanger l'échantillon en retournant délicatement et centrifuger à 7500 xg pendant 5 minutes à 4 ° C.
12. Après centrifugation, éliminer l'éthanol avec une pipette et permettre échantillon à sec tout inversé pendant 10 minutes.
13. Reprendre le culot en ajoutant 100 pi d'eau sans RNase et incuber l'échantillon à 55 ° C pendant 10 minutes. Il est recommandé aux doigts de vortex fréquemment pendant l'incubation à l'aide de réhydratation ARN. En option, vous pouvez vérifier la qualité et la quantité d'échantillon en utilisant un ND-1000 NanoDrop spectrophotomètre ou directement à l'étape suivante.

Partie 2: Nettoyage ARN utilisant le kit Qiagen RNeasy Mini

Le kit Qiagen RNeasy Mini ² est utile pour éliminer les contaminants et les impuretés d'un échantillon d'ARN isolé à partir d'autres méthodes. Pour cette procédure, β-mercaptoéthanol, l'éthanol et eau sans nucléase sont nécessaires en plus des composants inclus dans le kit. Un traitement optionnel DNAse est recommandé pendant cette procédure.

1. Dès la première utilisation de la trousse, tampon RPE devra être préparé par addition de 4 volumes d'éthanol à 100% à 1 volume de tampon RPE.
2. Le jour de la procédure, tampon RLT devront être préparés frais. Calculez le montant total de tampon RLT qui sera nécessaire. Un volume de 350 ul est nécessaire par échantillon. Pour préparer le tampon RLT, ajouter 10 l de β-mercaptoéthanol pour chaque 1 ml de tampon. Cela devrait être fait sous la hotte.
3. Pour chaque échantillon ajouter 350 ul du tampon RLT et 250 ul d'éthanol à 100%. Mélangez bien par aspiration et refoulement à plusieurs reprises.
4. Transférer l'échantillon, ce qui devrait être d'environ 700 ul, dans une colonne RNeasy qui est placé dans un tube collecteur de 2 ml et centrifuger à 8000 xg pendant 1 minute à température ambiante.
5. Après centrifugation, éliminer le flux à travers et ajouter 700 ul de tampon RW1 à une colonne RNeasy.
6. Centrifuger l'échantillon à 8000 xg pendant 1 minute à température ambiante, puis jetez le débit à travers.
7. Traitement à la DNase avec QIAGEN kit RNase-Free DNase: DNAse traitement est facultative mais fortement recommandée pour les échantillons de haute qualité.
   1. Lorsque vous recevez le kit de traitement à la DNase, vous aurez besoin pour préparer la solution de DNase I en ajoutant 550 ul eau sans nucléase de la DNAse. Mélanger doucement en inversant et ne vortex. Aliquoter dans des flacons à usage unique contenant 10 ul de la solution stock. Vous pouvez stocker la solution stock à -20 ° C jusqu'à 9 mois. Les aliquots décongelés peuvent être conservés à 4 ° C pendant 6 semaines si nécessaire, mais ne pas recongeler les aliquots après décongélation.
   2. Pour préparer le mélange incubation de DNase I ajouter 70 ul de tampon RDD à 10 ul DNAse I ssolution tac par échantillon. Mélanger par inversion douce et tube à centrifuger brièvement pour ramasser résiduelle sous forme liquide sur les côtés du tube. Ajouter 80 ul mélange incubation de DNase I directement à la colonne RNeasy. Incuber le traitement DNAse pendant 30 minutes à température ambiante.
8. Après le traitement DNAse ajouter 350 pi de tampon RW1 à la colonne et centrifuger à 8000 xg pendant 1 minute à température ambiante.
9. Après centrifugation jetez le débit à travers et ajouter 500 ul tampon RPE à la colonne spin. Incuber l'échantillon pendant 5 minutes à température ambiante.
10. Centrifuger l'échantillon à 8000 xg pendant 1 minute à température ambiante et jeter le débit à travers.
11. Après centrifugation ajouter 500 ul d'éthanol de 75% à la colonne.
12. Répétez centrifugation à 8000 xg, mais pour 2 minutes à température ambiante.
13. Après centrifugation jetez le débit à travers la colonne et permettre de sécher pendant 5 minutes.
14. Immédiatement centrifuger à 8000 xg pendant 5 minutes à température ambiante pour enlever tout à gauche sur les traces de l'éthanol.
15. Après centrifugation est un transfert complet de la colonne spin dans un nouveau tube collecteur de 1,5 ml et ajouter 10 ul eau sans nucléase. Incuber pendant 1 minute, puis centrifuger à 10 000 xg pendant 1 minute à température ambiante. L'ARN sera dans le flux à travers.
16. Ajouter un autre ul 10 de eau sans nucléase à la colonne de spin et incuber à température ambiante pendant 1 minute. Centrifuger l'échantillon à 10 000 xg pendant 1 minute à température ambiante.
17. Après centrifugation retirez et jetez la colonne. L'ARN sera dans le flux à travers.
18. Vérifiez la quantité et la qualité de l'ARN en utilisant une NanoDrop ND-1000 spectrophotomètre en suivant les instructions du fabricant.
19. En outre, d'exécuter un gel dénaturant ou d'utiliser un bioanalyseur Agilent 2100 pour vérifier l'intégrité de l'ARN.
20. Les échantillons doivent être conservés à -80 ° C jusqu'à ce que la synthèse d'ADNc peut être effectuée.

Partie 3: Synthèse d'ADNc en utilisant l'Invitrogen SuperScript premier brin système

L'ARN est facilement sujette au clivage par ARNases conduisant à la dégradation. En conséquence de nombreux protocoles d'expression génique ont été développés pour utiliser un produit plus stable d'ADNc qui a été directement synthétisés à partir de l'ARN. Voici la synthèse des détails que nous premier brin d'ADNc en utilisant le système d'Invitrogen SuperScript Synthèse du premier volet ^3. Chaque réaction de synthèse d'ADNc peut accueillir jusqu'à 5 ug d'ARN.

1. Avant de commencer le mélange procédure et centrifuger brièvement chaque composante.
2. Préparer ARN / mélange de primer dans un tube de micro stérile de 0,5 ml comme indiqué dans le tableau 1.
3. Incuber l'échantillon à 65 ° C pendant 5 minutes.
4. Immédiatement le transfert de l'échantillon à coulis de glace pendant 10 minutes.
5. Alors que l'échantillon est de refroidissement préparer un master mix avec les composants décrits dans le tableau 2. Les volumes sont répertoriés par une réaction. Ajustez le volume en conséquence pour le nombre total de réactions.
6. Après refroidissement, ajouter 9 ul du mélange maître préparé à l'étape 5 pour chaque ARN / mélange d'amorces. Mélanger délicatement et recueillir par centrifugation brève. Le volume total de chaque échantillon doit être de 19 pi.
7. Incuber l'échantillon à 42 ° C pendant 2 minutes dans un thermocycleur.
8. Ajouter 1 ul (50 unités) de SuperScript II RT dans chaque tube, mélanger et incuber à 42 ° C pendant 60 minutes dans un thermocycleur.
9. Terminer la réaction à 70 ° C pendant 15 minutes, puis réfrigérer l'échantillon à 4 ° C. Un thermocycleur peut être programmé pour des étapes 8 et 9.
10. Après l'échantillon a atteint 4 ° C, le transfert de la réaction d'un bain de glace.
11. Sur la glace ajouter 1 l de RNAse H pour chaque tube et incuber pendant 20 minutes à 37 ° C. Le volume total est maintenant de 21 pi. Ajout de la RNAse H pour votre échantillon va dégrader la matrice ARN et ne laisser que le produit seul brin d'ADNc.

Partie 4: Isolement d'ADNc et des précipitations

1. Une phase de 1,5 ml de gel de verrouillage du tube sera utilisé dans l'isolation du produit d'ADNc. Préparer une phase de 1,5 ml de gel de verrouillage du tube par centrifugation à 12000 xg pendant 2 minutes. Le gel devraient tous être au fond du tube.
2. Ajouter 81,5 ul de phénol (Tris-saturés, tamponné à pH 8,0), 81,5 l de chloroforme alcool isoamylique 24:1, et l'échantillon (21 ul) dans le tube de gel à verrouillage de phase. Mélanger plusieurs fois par inversion douce.
3. Centrifuger l'échantillon à 12 000 xg pendant 5 minutes à température ambiante.
4. L'ADNc doit être dans la phase aqueuse supérieure. Transférer la phase supérieure dans un tube de centrifugeuse propre de 1,5 ml. Le volume total devrait être d'environ 20 pl.
5. Ajouter 1X volume de 3 M NaOAc, pH 5,2 et mélanger doucement. Par exemple, si le volume de la phase aqueuse supérieure est égale à 20 pl, vous aurez besoin d'ajouter 2 pi de NaOAc 3 M, pH 5,2.
6. Ajouter 7 l de 5 mg / ml de glycogène et mélanger délicatement.
7. Ajouter 1X volume d'isopropanol et mélanger doucement. En général, cela se situe autour de 30 ul d'isopropanol.
8. Laisser l'échantillon à incuber à températur ambiantee pendant 10 minutes et puis centrifuger à 12 000 xg pendant 20 minutes à température ambiante.
9. Une petite pastille d'ADNc devraient former sur le fond du tube. Retirer délicatement le surnageant avec une pipette.
10. Ajouter 500 ul d'éthanol à 70% et mélanger par retournement.
11. Centrifuger l'échantillon à 12 000 xg pendant 5 minutes.
12. Après centrifugation éliminer le surnageant avec une pipette et répéter le lavage à l'éthanol 70% et de centrifugation (étapes 10 et 11).
13. Après centrifugation éliminer le surnageant avec une pipette. S'il ya du liquide restant sur les parois du tube, il peut être recueilli par une brève filature le tube. Retirez tout excès de liquide et de permettre le culot sécher à température ambiante pendant 5 minutes.
14. Ajouter 20 ul d'eau sans nucléase pour réhydrater la pastille. Placer l'échantillon à 55 ° C pendant 5 minutes pour la réhydratation de la pastille.
15. La quantité et la qualité du produit d'ADNc est ensuite vérifiée en utilisant un NanoDrop ND-1000 spectrophotomètre en suivant les instructions du fabricant. L'ADNc peut être conservé à -20 ° C.

Les résultats représentatifs

Après le nettoyage d'ARN, d'environ 15 ug de haute qualité de l'ARN total peut être attendu de 50 embryons de poissons zèbres. Pour évaluer la qualité totale ARN, un spectrophotomètre, électrophorèse sur gel, et un bioanalyseur Agilent 2100 peut être utilisé. A ND-1000 NanoDrop spectrophotomètre peut être utilisé pour évaluer l'absorption à 260 nm en comparaison de l'absorbance à 280 nm (figure 1). L'A ₂₆₀ / A ₂₈₀ peut révéler la présence de contaminants et de donner des preuves de la dégradation possible. Un A ₂₆₀ / A ₂₈₀ de 1,9 à ​​2,0 est considéré comme acceptable. En outre, il est fortement recommandé que la dénaturation d'un gel d'ARN être exécuté pour évaluer l'intégrité des ARN. Brins d'ARN sera séparé sur base de leur taille, avec de petits brins migrent plus loin dans le gel. Un échantillon non dégradé apparaîtra comme un frottis avec deux bandes fortes. Le frottis est un résultat d'une population de différents brins d'ARNm de taille et les bandes correspondent aux ARNr 28S et 18S. Le groupe 28S doit être environ deux fois plus intense que la bande 18S (figure 2). Alternativement, une totale intégrité ARN peut être évaluée en utilisant une bioanalyseur Agilent 2100. Deux pics distincts représentant l'ARNr 28S et 18S est attendue (figure 3). Le pic 28S doit être plus grand que le pic de 18S avec l'aire sous les pics d'environ 2:1, respectivement. Deux pics distincts ne sera pas observée dans les échantillons dégradés. Les échantillons d'ARN présentant la dégradation ne doit pas être réalisée grâce à des procédures expérimentales ultérieures.

Analyse spectrophotométrique peut être utilisé pour évaluer la qualité du produit d'ADNc (figure 4). L'A ₂₆₀ / A ₂₈₀ devrait être d'environ 1,8. réactions d'ADNc avec une entrée de 5 ug d'ARN total systématiquement le rendement mg ​​1-2 de produit d'ADNc dans notre laboratoire.

Figure 1. Un spectre d'échantillon d'ARN NanoDrop. Après le nettoyage d'ARN, la quantité d'ARN et de la qualité peut être évaluée en utilisant un ND-1000 NanoDrop spectrophotomètre. Environ 15 pg d'ARN total élevé de qualité est systématiquement donné de 50 embryons de poissons zèbres avec un A ₂₆₀ / A ₂₈₀ autour de 1,9 à ​​2,0.

Figure 2. Un gel dénaturation ARN. Afin d'évaluer l'intégrité de l'isolement d'ARN total, un gel dénaturation ARN peut être couru. Un frottis avec deux bandes brillantes correspondant à l'ARNr 28S et 18S est attendue. Le groupe 28S doit être environ deux fois plus intense que la bande 18S.

Figure 3. Une trace d'un échantillon d'ARN à partir d'un bioanalyseur. Afin d'évaluer l'intégrité de l'isolement d'ARN total, les échantillons peuvent aussi être analysés sur une bioanalyseur Agilent 2100. Deux pics, correspondant à l'ARNr 28S et 18S, devrait être visible. Le pic 28S doit être plus grand que le pic de 18S avec l'aire sous les pics d'environ 2:1, respectivement.

Figure 4. Un spectre NanoDrop d'un échantillon d'ADNc. Analyse spectrophotométrique avec un NanoDrop ND-1000 peut être utilisé pour évaluer la quantité et la qualité du produit d'ADNc. L'A ₂₆₀ / A ₂₈₀ devrait être d'environ 1,8. réactions d'ADNc avec une entrée de 5 ug d'ARN total régulièrement le rendement de 1 à 2 ug d'ADNc dans notre laboratoire.

Tableau 1. Composants à ajouter pour l'ARN / mélanges amorce à l'étape 2 de la synthèse de l'ADNc.

Composante	Volume
L'ARN total (jusqu'à 5 ug)	10 ul
Mélange de dNTP 10 mM	1 pl
Oligo (dT) 12-18 (0,5 pg / pl)	1 pl
DEPC eau traitée	ul n
Le volume total	10 ul

Mélange de réaction Tableau 2. Pour l'étape 5 de la synthèse de l'ADNc. Les volumes indiqués sont par réaction. Augmenter le volume de chaque composant pour le nombre total de réactions.

Composante	Volume
10X tampon RT	2 pl
25 mM de MgCl2	4 pl
0,1 mM de DTT	2 pl
RNAseOUT	1 pl

Discussion

La fragilité de la molécule d'ARN est le facteur le plus critique qui devrait se rappeler tout au long de ce protocole. Matériel stérile qui est RNAse free devrait toujours être utilisé dans une zone de RNAse free du laboratoire. Il est utile de réserver une partie du laboratoire pour être utilisés pour les procédures d'ARN seulement. Cette zone doit être fréquemment pulvérisés avec un produit RNAse enlever, comme RNAse Away. Les échantillons d'ARN devraient toujours être manipulés avec des ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycogen (5 mg/ml)	Ambion	9510
NanoDrop ND-100	Thermo Fisher Scientific, Inc.	ND-1000
Pellet Pestles with Microfuge Tube	VWR international	KT749520-0090
Phase Lock Gel Light, 1.5 ml	Eppendorf	2302800
Phenol, Tris-saturated	Roche Group	3117944001
RNAse Away	VWR international	17810-491
RNAse-Free DNase Set	Qiagen	79254
RNEasy Mini Kit	Qiagen	74104
SuperScript® First-Strand Synthesis System for RT-PCR	Invitrogen	11904-018
TRIzol	Invitrogen	15596-026