Gen İfadesi Analizi Embriyonik Zebra balığı ve cDNA Sentezi RNA İzolasyon

Özet

Yüksek kalitede izolasyonu, RNA bozulmamış birçok laboratuar protokolleri önemli bir adımdır. Burada, bütün zebrafish embriyolar ve gen ekspresyon mikrodizi analizi de dahil olmak üzere çeşitli deneysel prosedürleri müteakip uygulama için cDNA sentezi RNA ekstraksiyon göstermektedir.

Özet

Birçok önemli ve karmaşık laboratuvar işlemleri, yüksek kaliteli, sağlam RNA bir giriş gerektirir. Bozulmuş bir örnek veya yabancı maddelerin varlığı downstream deneysel uygulamalar felaket sonuçlarına yol açabilir. , Bu nedenle üstün bir örnek sağlamak için çok sayıda güvence ve kalite kontrol katı tekniklerini kullanmak için büyük önem taşımaktadır. Burada, biz detay izleri ticari bir RNA izolasyon kiti kullanılarak DNA ve kirleri çıkarmak için, piyasada yaygın olarak bulunan kimyasal denaturant ve daha sonraki temizleme kullanarak tüm zebrafish embriyolar toplam RNA izole etmek için bir protokol. RNA nispeten istikrarsız ve RNAses tarafından bölünme kolayca eğilimli olduğu gibi, çoğu protokolleri tahlil gen ekspresyon doğrudan bir RNA sentezlenir bir cDNA ürün. Biz, ayrıntılı bir prosedür RNA ticari kiti kullanılarak, daha istikrarlı bir cDNA ürün haline dönüştürmek için. Bu işlemler boyunca örnek bozulmuş veya kontamine olmadığından emin olmak için birçok kalite kontrol vardır. Mikroarray analizi, RT-PCR veya uzun süreli depolama için uygun olup olmadığını bu protokollerin son ürün cDNA.

Protokol

Bölüm 1: TRIzol Reaktif kullanarak Total RNA ekstraksiyonu

RNA ile çalışırken RNAses serbest olduğu bir ortamda çalışmak çok önemlidir. Sadece RNA prosedürleri ile kullanım için ayrılmış pipetler ve prosedürü başlamadan önce bir dekontaminant reaktif (örneğin, RNAse Uzakta) ile çalışma alanı püskürtme gibi basit önlemler çok yararlı.

1. 1,5 ml mikrofuge'de tüpünde RNA havuzu 50 zebrafish embriyoların yeterli miktarda elde etmek ve bir pipet ile mümkün olduğunca çok su çıkarmak için.
2. Hemen TRIzol reaktif ¹ 250 ul embriyoları içeren mikrofuge'de tüp ekleyin. TRIzol reaktif fenol içerir ve sadece davlumbaz altında kullanılmalıdır.
3. Pelet havaneli (yaklaşık 20 vuruş) ile embriyoların doku yeterince bozulur kadar Lyse ve homojenize.
4. Hücreleri yeterince homojenize zaman eşit, toplam hacim 1 ml 750 ul TRIzol reaktif ekleyin.
5. Nükleoprotein kompleksleri tam ayrılma izni için homojenize edilmiş örnekleri, oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Bu aşamada, örnek flaş sıvı nitrojen içinde dondurulmuş ve -80 ° C ya da protokol devam edilebilir saklanan olabilir.
6. 0.2 ml kloroform devam edecek ve 15 saniye karıştırın tüp rock.
7. Oda sıcaklığında 2 dakika sonra 15 dakika boyunca 12.000 xg'de santrifüj 4 örnek inkübe ve ° C.
8. Karışım daha düşük bir kırmızı fenol-kloroform fazı, interfaz ve renksiz bir üst sulu faz ayırmak. Üst sulu faz RNA içerir. TRIzol (yaklaşık 0,6 ml) ilk hacminin yaklaşık% 60 üst tabaka oluşur. Interfaz tabakanın herhangi bir transfer için değil dikkatli olmak 1 ml pipet kullanarak yeni bir mikrofuge'de tüpe üst sulu tabaka aktarın.
9. RNA 0.5 ml izopropanol eklemek çöktürmek için.
10. İzin örnek oda sıcaklığında 10 dakika oturup sonra 4 az 10 dakika 12.000 xg'de örnek santrifüj ° C. RNA tüpün altındaki bir jel gibi pelet oluşturacaktır.
11. Pelet rahatsız olmadan, bir pipet ile süpernatantı kaldırmak ve 1 ml% 75 etanol pelet yıkayın. 4, 5 dakika boyunca 7.500 xg'de hafifçe çevirerek ve santrifüj örnek karıştırın ° C
12. Santrifüj sonra, bir pipet ile etanol kaldırmak ve 10 dakika için ters örnek kurumasını bekleyin.
13. 100 ul RNAse ücretsiz su ekleyerek pelletini tekrar ve örnek inkübe 55 ° C'de 10 dakika. Bu RNA rehidrasyon yardımcı olmak üzere kuluçka sırasında sık sık vorteks parmak tavsiye edilir. İsterseniz, örnek nitelik ve nicelik NanoDrop ND-1000 spektrofotometre kullanarak kontrol edebilirsiniz ya da doğrudan bir sonraki adıma geçin.

Bölüm 2: Qiagen RNEasy Mini Kit kullanılarak RNA Temizleme

Qiagen RNEasy Mini Kit ^2, diğer yöntemlerle izole bir RNA örnek kirleticiler ve kirleri giderilmesinde yararlıdır . Bu işlem için, β-merkaptoetanol, etanol ve nükleaz ücretsiz su Set içinde yer alan bileşenlere ek olarak ihtiyaç vardır. Bu işlem sırasında, isteğe bağlı bir DNAz tedavi tavsiye edilir.

1. Kitinin ilk kullanımdan sonra, Tampon RPE Tampon RPE 1 hacim% 100 etanol 4 cilt ekleyerek hazırlıklı olmak gerekir.
2. Tampon RLT prosedürü gün taze olarak hazırlanması gerekecektir. Tampon RLT gerekli olacak toplam tutarı hesaplayın. Numune başına 350 ul bir hacim gereklidir. Tampon RLT hazırlamak için, her 1 ml tampon için β-mercaptoethanol 10 ul ekleyin. Bu davlumbaz altında yapılmalıdır.
3. Her bir numune için 350 Tampon RLT ul ve% 100 etanol 250 ul ekleyin. Birkaç kez aşağı yukarı pipetleme iyi karıştırın.
4. Oda sıcaklığında 1 dakika için 8000 xg'de 2 ml toplama tüpü ve santrifüj yerleştirilen bir RNEasy sütuna, yaklaşık 700 ul örnek aktarın.
5. Santrifüj sonra, üzerinden akış atmak ve Tampon RW1 700 ul RNEasy bir spin kolon eklemek.
6. Oda sıcaklığında 1 dakika için 8000 xg'de örnek Santrifüj ve sonra akış atmak.
7. DNAz Qiagen RNAse-Alerjik DNAz Kiti ile tedavi: DNAz tedavi isteğe bağlıdır ancak son derece yüksek kalitede örnekleri için tavsiye edilir.
   1. DNAz tedavi kiti ilk aldığınızda, DNAz 550 ul nükleaz içermeyen su ekleyerek DNAz I stok solüsyonu hazırlamak için ihtiyacınız olacak. Evirerek yavaşça karıştırın ve vorteks yok. Tek kullanımlık flakon içine 10 ul stok solüsyonu içeren kısım. , 9 aya kadar -20 ° C'de stok solüsyonu saklayabilirsiniz. Çözülmüş alikotları 4 ° C'de 6 hafta için gerekirse saklanabilir, ancak çözülme sonra alikotları dondurursam yok.
   2. DNAz I inkübasyon karışımı hazırlamak için, 10 ul DNAz I s RDD 70 ul Tampon eklemekörnek başına tak çözüm. Yavaşça tersine çevirerek karıştırın ve santrifüj tüpüne kısaca rezidüel sıvı formda tüp taraf toplamak için. Doğrudan RNEasy spin kolon 80 ul DNAz I inkübasyon karışımı ekleyin. DNAz tedavi oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
8. Aşağıdaki DNAz tedavi oda sıcaklığında 1 dakika için 8000 xg'de spin kolon ve santrifüj 350 ul Tampon RW1 ekleyin.
9. Santrifüj yoluyla akışı atmak ve spin kolon 500 ul Tampon RPE ekledikten sonra. Örnek oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
10. Santrifüj ve oda sıcaklığında 1 dakika için 8000 xg'de örnek üzerinden akış atın.
11. 500 ul% 75 etanol santrifüj sonra spin kolon ekleyin.
12. 8.000 xg santrifüj yineleyin, ancak oda sıcaklığında 2 dakika boyunca.
13. Santrifüj yoluyla akışı atmak ve sütun 5 dakika kurumasını bekleyin sonra.
14. Hemen etanol izleri üzerinde herhangi bir sol kaldırmak için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 8.000 xg'de santrifüj.
15. Santrifüj işlemi tamamlandıktan sonra transferi 1,5 ml yeni bir toplama tüpüne spin kolon ve 10 ul nükleaz içermeyen su ekleyin. 1 dakika boyunca inkübe ve sonra oda sıcaklığında 1 dakika 10.000 xg'de santrifüj. RNA yoluyla akışı olacak.
16. Spin kolon başka bir 10 ul nükleaz ücretsiz su ekleyin ve 1 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Örnek oda sıcaklığında 1 dakika 10.000 xg'de santrifüjleyin.
17. Santrifüj sonra çıkarın ve spin kolon silmek. RNA yoluyla akışı olacak.
18. Üreticinin talimatları izleyerek NanoDrop ND-1000 spektrofotometre kullanılarak RNA miktarını ve kalitesini kontrol edin.
19. Buna ek olarak, denatüre jel çalıştırmak veya RNA bütünlüğünü denetlemek için bir Agilent 2100 bioanalyzer kullanın.
20. CDNA sentezi yapılabilir Örnekleri -80 ° C ye kadar saklanabilir.

Bölüm 3: İlk Strand Invitrogen Üst Simge Sistemi kullanılarak cDNA Sentezi

RNA kolayca bozulmasına neden RNAses tarafından bölünme eğilimli. Bunun sonucunda birçok gen ekspresyonu protokolleri doğrudan RNA sentezlenir olmuştur daha istikrarlı cDNA bir ürünü kullanmak için geliştirilmiştir. Invitrogen Üst Simge İlk Strand Sentez Sistemi ³ kullanarak ilk iplikçik cDNA burada ayrıntılarıyla sentezi. Her cDNA sentezi reaksiyonu, RNA'nın 5 mg kadar hizmet verebilir.

1. Prosedürü karışımı başlamadan önce ve her bir bileşenin kısaca santrifüj.
2. Tablo 1'de belirtildiği gibi 0,5 ml steril bir mikrofuge'de tüp RNA / astar karışım hazırlayın.
3. Örnek 65 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
4. Hemen 10 dakika boyunca buz bulamaç örnek aktarın.
5. Örnek Tablo 2'de belirtilen bileşenleri ile bir ana karışımı hazırlamak soğutma iken. Miktarlar 1 reaksiyon başına listelenmiştir. Buna göre reaksiyon toplam sayısı için hacimleri ayarlayın.
6. Soğuduktan sonra, 9 ul 5. adımda her RNA / astar karışımı hazırlanan master karışımı ekleyin. Yavaşça karıştırın ve kısa süreli santrifüj toplamak. Her numunenin toplam hacmi 19 ul olmalıdır.
7. Örnek bir termalcycler 2 dakika 42 ° C'de inkübe edin.
8. 1 ul Üst Simge II RT (50 adet), her tüp karışımı, 42 inkübe ° C de 60 dakika bir termalcycler.
9. 70 reaksiyon sonlandırın sonra ° C ve 15 dakika boyunca 4 ° C'ye kadar chill örnek PCR 8 ve 9 adımları için programlanmış olabilir.
10. Örnek 4 ° C ulaştıktan sonra, bir buz banyosunda reaksiyon aktarın.
11. Buz üzerinde her tüpe 1 RNAse H ul eklemek ve 37 az 20 dakika boyunca inkübe ° C Toplam hacmi 21 ul. RNAse H örnek eklenmesi RNA aşağılamak ve sadece tek iplikçik cDNA ürün bırakacaktır.

Bölüm 4: cDNA İzolasyon ve Yağış

1. 1,5 ml faz kilidi jel tüpü cDNA ürün izolasyonu kullanılır. 2 dakika boyunca 12.000 xg'de santrifüj 1,5 ml faz kilidi jel tüpü hazırlayın. Jel tüpün alt kısmında olmalıdır.
2. (21 ul), (Tris-doymuş pH 8.0 tamponlu) 81.5 ul fenol 24:1 kloroform izoamil alkol 81.5 ul ve örnek faz kilidi jel tüpü içine ekleyin. Birkaç kez yavaşça tersine çevirerek karıştırın.
3. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 12.000 xg'de örnek santrifüjleyin.
4. CDNA üst sulu faz olmalıdır. Üst faz temiz bir 1.5 ml mikrofuge'de tüp içine aktarın. Toplam hacmi 20 ul civarında olmalıdır.
5. 3 M NaOAc, pH 5.2 1X hacmi ekleyin ve hafifçe karıştırın. Örneğin üst sulu faz hacminin 20 ul eşit ise, 3 M NaOAc, pH 5.2 2 ul eklemek gerekecektir.
6. 5 mg / ml glikojen 7 ul ekleyin ve hafifçe karıştırın.
7. 1X hacim izopropanol ekleyin ve hafifçe karıştırın. Genellikle bu yaklaşık 30 ul izopropanol.
8. Örnek oda ısısı inkübe izin versonra 10 dakika boyunca e ve oda sıcaklığında 20 dakika 12.000 xg'de santrifüj.
9. Tüpün alt kısmında küçük bir cDNA pelet oluşturmalıdır. Süpernatantı bir pipet yardımıyla dikkatlice çıkarın.
10. % 70 etanol ve tersine çevirerek karıştırın 500 ul ekleyin.
11. Örnek 5 dakika 12.000 xg'de santrifüjleyin.
12. Santrifüj bir pipet ile süpernatantı kaldırmak ve% 70 etanol yıkama ve santrifüj (10 ve 11. adımları) tekrarlayın sonra.
13. Santrifüj sonra bir pipetle süpernatant çıkarın. Tüp tarafta kalan sıvı varsa, kısaca tüp iplik elde edilebilir. Herhangi bir aşırı sıvı çıkarın ve pelet 5 dakika boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
14. Pelet rehidrate 20 ul nükleaz içermeyen su ekleyin. Pelet rehidrasyon için 5 dakika süreyle 55 ° C'de örnek yerleştirin.
15. CDNA ürün miktarı ve kalitesi daha sonra üreticinin talimatlarına aşağıdaki NanoDrop ND-1000 spektrofotometre kullanılarak kontrol edilir. CDNA -20 ° C'de saklanabilir

Temsilcisi Sonuçlar

RNA temizleme sonra, yüksek kalitede toplam RNA yaklaşık 15 mikrogram 50 zebrafish embriyolardan beklenebilir. Toplam RNA kalite, spektrofotometre, jel elektroforezi, ve bir Agilent 2100 Bioanalyzer değerlendirmek için kullanılabilir. NanoDrop ND-1000 spektrofotometre, 260 nm'de absorbans 280 nm (Şekil 1) absorbans karşılaştırma değerlendirmek için kullanılabilir. A ₂₆₀ / A ₂₈₀ oranı bulaşanların varlığının ortaya çıkarmak ve olası bir bozulma kanıt verebilir. Bir A ₂₆₀ / A ₂₈₀ oranı 1,9-2,0 arasında kabul edilir. Buna ek olarak, yüksek bir RNA denatürasyon jel RNA bütünlüğünü değerlendirmek için çalışılması tavsiye edilir. RNA ipliklerini jel küçük iplikçikler daha aşağı göç eden, onların büyüklük bazında ayrı olacaktır. Uğramamış bir örnek, iki güçlü bantları ile bir karalama olarak görünecektir. Smear, farklı büyüklükte mRNA ipliklerini bir nüfusun bir sonucudur ve bantları 28S ve 18S rRNA karşılık. 28S grup 18S bantlı (Şekil 2) olarak yaklaşık iki kat daha yoğun olmalıdır. Alternatif olarak, toplam RNA bütünlüğünü Agilent 2100 bioanalyzer kullanarak tespit edilebilir. 28S ve 18S rRNA temsil eden iki ayrı doruklarına beklenmektedir (Şekil 3). 28S tepe doruklarına altında kalan alan ile tepe 18S yaklaşık 02:01, sırasıyla daha büyük olmalıdır. İki farklı zirveleri bozulmuş örneklerde gözlenen olmayacaktır. RNA örnekleri sergileyerek bozulması sonraki deneysel prosedürleri ile yapılmamalıdır.

Spektrofotometrik analiz (Şekil 4) cDNA ürün kalitesini değerlendirmek için kullanılabilir. A ₂₆₀ / A ₂₈₀ 1.8 civarında olmalıdır. toplam RNA'nın 5 mikrogram bir giriş ile cDNA reaksiyonlar laboratuvarda rutin olarak 1-2 mg cDNA ürün verir.

Şekil 1. RNA örnek NanoDrop spektrumu. RNA temizleme sonra, RNA miktarı ve kalitesi NanoDrop ND-1000 spektrofotometre kullanılarak değerlendirilmiştir olabilir. Yüksek kalite toplam RNA yaklaşık 15 mikrogram rutin 1,9-2,0 civarında bir A ₂₆₀ / A ₂₈₀ oranı ile 50 zebrafish embriyolar vermiştir.

Şekil 2. Bir RNA denatürasyon jel toplam RNA izolasyonu bütünlüğünü değerlendirmek için, bir RNA denatürasyon jel koştu olabilir. 28S ve 18S rRNA karşılık gelen iki parlak bantlar ile smear bekleniyor. 28S grup 18S bantlı olarak yoğun olarak yaklaşık iki katı olmalıdır.

Şekil 3. Toplam RNA izolasyonu bütünlüğünü değerlendirmek bir bioanalyzer. RNA örnek bir iz, örnekleri de bir Agilent 2100 bioanalyzer analiz olabilir. 28S ve 18S rRNA karşılık gelen iki sivri tepeler, görünür olmalıdır. 28S tepe doruklarına altında kalan alan ile tepe 18S yaklaşık 02:01, sırasıyla daha büyük olmalıdır.

Şekil 4. CDNA bir örnek NanoDrop spektrumlu bir NanoDrop ND-1000 ile Spektrofotometrik analiz cDNA ürünün miktarı ve kalitesini değerlendirmek için kullanılabilir. A ₂₆₀ / A ₂₈₀ oranı 1.8 civarında olmalıdır. toplam RNA 5 ug bir giriş ile cDNA reaksiyonlar rutin laboratuvarda cDNA 1-2 ug verim.

Tablo 1 Bileşenleri, cDNA sentezi 2. adım, RNA / astar karışımları için eklemek için.

Bileşen	Hacim
Toplam RNA (5 mg)	10 ul
10 mM dNTP karışımı	1 ul
Oligo (dT) 12-18 (0.5 mg / ml)	1 ul
DEPC-arıtılmış su	n ul
Toplam hacim	10 ul

Tablo 2. cDNA sentezi 5. adım Reaksiyon karışımı. Listelenen Hacimler tepki başına. Reaksiyon toplam sayısı için her bileşen hacimleri artırın.

Bileşen	Hacim
10X RT Tampon	2 ul
25 mM MgCl2	4 ul
0.1 mM DTT	2 ul
RNAseOUT	1 ul

Tartışmalar

RNA molekülü kırılganlık bu protokolü boyunca hatırlanması gereken gereken en önemli husustur. RNAse-ücretsiz steril laboratuvar RNAse serbest bölge her zaman kullanılmalıdır. Sadece RNA işlemleri için kullanılacak laboratuvar bir bölümünü ayırmak için yararlı olur. Bu alan, sık sık Away gibi RNAse RNAse kaldırarak ürün, püskürtülmüş olmalıdır. RNA örnekleri her zaman eldiven ile ele almış ve bozulmasını önlemek için buz üzerinde tutulmalıdır olmalıdır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycogen (5 mg/ml)	Ambion	9510
NanoDrop ND-100	Thermo Fisher Scientific, Inc.	ND-1000
Pellet Pestles with Microfuge Tube	VWR international	KT749520-0090
Phase Lock Gel Light, 1.5 ml	Eppendorf	2302800
Phenol, Tris-saturated	Roche Group	3117944001
RNAse Away	VWR international	17810-491
RNAse-Free DNase Set	Qiagen	79254
RNEasy Mini Kit	Qiagen	74104
SuperScript® First-Strand Synthesis System for RT-PCR	Invitrogen	11904-018
TRIzol	Invitrogen	15596-026