유전자 발현 분석을위한 배아 Zebrafish 및 cDNA 합성에서 RNA 격리

요약

양질의 절연이 손상 RNA는 많은 실험실 프로토콜에서 필수적인 단계입니다. 여기, 우리는 전체 zebrafish의 배아 및 유전자 표현 microarray 분석 등 다양한 실험 절차에 후속 응용 프로그램에 대한 cDNA 합성에서 RNA 추출을 보여줍니다.

초록

대부분의 중요하고 복잡한 실험 절차는 고품질, 손상 RNA의 입력을 필요로합니다. 타락한 샘플이나 불순물의 존재는 하류 실험 응용 프로그램에서 치명적인 결과를 초래할 수 있습니다. 그것은 우수한 샘플을 보장하기 위해 다양한 안전 및 품질 관리 검사와 견고한 기술을 사용하는 가장 중요 따라서이다. 여기에, 우리는 세부 상업 RNA 분리 키트를 사용하여 DNA와 불순물의 흔적을 제거하는 상용 화학 denaturant 이후 정리를 사용하여 전체 zebrafish의 배아에서 총 RNA를 분리하는 프로토콜. RNA는 상대적으로 불안정하고 RNAses에 의해 절단 쉽게 경향이 있으므로, 대부분의 프로토콜 분석 유전자 발현 직접 RNA의 템플릿에서 합성되는 cDNA 제품을 사용하고 있습니다. 우리는 세부 절차를 상용 키트를 사용하여보다 안정적인 cDNA 제품에 RNA를 변환합니다. 이러한 절차를 통해 샘플 강등 당하거나 오염되지 않도록하기 위해 다양한 품질 관리 검사가 없습니다. 이러한 프로토콜의 최종 제품은 microarray 분석, RT - PCR 또는 장기 보관에 적합한 것을 cDNA입니다.

프로토콜

1 부 : TRIzol 시약을 사용하여 총 RNA의 추출

RNA와 함께 작업하는 경우가 RNAses 무료입니다 환경에서 작동하는 것은 매우 중요합니다. 이러한 RNA 절차에만 사용하기 위해 예약된 pipettes가 발생하고 절차를 시작하기 전에 decontaminant 시약 (예 : RNAse 거리)로 작업 영역을 분사와 같은 간단한주의 사항은 매우 도움이됩니다.

1. 1.5 ML의 microfuge 튜브에 RNA 수영장 50 zebrafish의 배아 충분한 양의 달성하고 피펫과 함께 가능한 한 많은 물을으로 제거하려면 다음과 같이하십시오.
2. 바로 배아를 포함하는 microfuge 튜브에 TRIzol 시약 ¹ 250 μl를 추가합니다. TRIzol 시약은 페놀이 포함되어 있습니다 단 퓸 후드에서 사용해야합니다.
3. 조직이 충분히 교란 때까지 펠렛 유봉 (약 20 치기)와 배아를 Lyse 및 균질.
4. 세포가 충분히 균질 경우 1 ML 총 볼륨을 동일하기 위해 750 μl TRIzol 시약을 추가합니다.
5. 핵 단백질의 단지의 완전한 분리를 허용하려면, 실온에서 5 분 균질 샘플을 품어. 이 단계에서는 예제 플래시 액화 질소에 냉동 및 -80 ° C에서 또는 프로토콜이 계속 수 있습니다 저장할 수 있습니다.
6. 클로로포름의 0.2 ML를 추가 계속 믹스 15 초 동안 튜브를 일으키고.
7. 4 15 분 동안 12,000 XG에 원심 분리기 다음 상온에서 2 분 동안 샘플을 품어하고 ° C.
8. 혼합물은 낮은 붉은 페놀 - 클로로포름 위상, 계면 및 무색 위 수성 단계로 구분됩니다. 위 수성 단계는 RNA가 포함되어 있습니다. 상위 레이어는 TRIzol (약 0.6 ML)의 초기 부피의 약 60 %를 구성한다. 계면 층 중 하나를 전송하지 않도록주의하는 1 ML의 피펫을 사용하여 새 microfuge 튜브로 가기 수성 레이어를 전송합니다.
9. RNA는 0.5 ML 이소프로판올를 추가 촉진합니다.
10. 샘플 10 분 실온에서 앉아 후 4 10 분 12,000 XG에서 샘플을 원심 수 있도록 허용 ° C. RNA는 튜브의 바닥에 젤 같은 펠렛을 형성합니다.
11. 펠렛을 방해하지 않고, 피펫으로 뜨는을 제거하고 한 ML 75 % 에탄올에 펠렛 씻으십시오. 4 5 분 7500의 XG에 부드러운 역전과 원심 분리기에 의해 샘플을 혼합 ° C.
12. 원심 분리 후 피펫으로 에탄올을 제거하고 10 분 동안 거꾸로 샘플 건조 수 있습니다.
13. RNAse없는 물 100 μl를 추가하여 펠렛을 Resuspend 55에서 샘플을 품어 ° C를 10 분. 이것은 RNA의 rehydration에 도움을 배양하는 동안 자주 와동을 손가락을 권장합니다. 선택, 당신은 NanoDrop ND - 1000 분광 광도계를 사용하여 샘​​플의 품질과 수량을 확인하거나 직접 다음 단계를 계속합니다.

2 부 : Qiagen RNEasy 미니 키트를 사용하여 RNA 정리

Qiagen RNEasy 미니 키트 ² 다른 방법에서 분리된 RNA 샘플에서 오염 물질 및 불순물을 제거하는 데 유용합니다. 이 절차에 대한, β - 메르 캅 토 에탄올, 에탄올, 그리고 nuclease없는 물이 키트에 포함된 구성 요소에 추가로 필요합니다. 옵션 DNAse 치료는이 절차를 수행하는 동안 권장합니다.

1. 키트의 처음 사용시, 버퍼 RPE는 버퍼 RPE 1 볼륨에 100 % 에탄올 4 볼륨을 추가하여 준비해야합니다.
2. 절차의 날, 버퍼 RLT 신선한 준비해야합니다. 필요한 것입니다 버퍼 RLT의 총 금액을 계산합니다. 350 μl의 볼륨 샘플마다 필요합니다. 버퍼 RLT를 준비하려면, 버퍼의 모든 1 ML에 대한 β - 메르 캅 토 에탄올 10 μl를 추가합니다. 이것은 퓸 후드 아래에 완료해야합니다.
3. 각 견본 버퍼 RLT 350 μl와 100 % 에탄올 250 μl를 추가합니다. 몇 시간을 아래와 pipetting으로 잘 섞는다.
4. 실온에서 1 분 8,000 XG에 2 ML 수집 관과 원심 분리기에 배치됩니다 RNEasy 열에 약 700 μl되어야 샘플을 전송합니다.
5. centrifuging 후,을 통해 흐름을 버리고 RNEasy 스핀 열 버퍼 RW1 700 μl를 추가합니다.
6. 실온에서 1 분 8,000 XG에서 샘플을 원심 다음을 통해 흐름을 폐기.
7. Qiagen RNAse - 무료 DNAse 키트와 함께 DNAse 치료 : DNAse 치료는 선택 사항이지만 매우 최고 품질의 샘플을 권장합니다.
   1. 먼저 DNAse 처리 키트를받을 때, 당신은 DNAse에 550 μl nuclease 무료 물을 추가하여 DNAse I 주식 솔루션을 준비해야합니다. 반전에 의해 부드럽게 섞어 와동하지 않습니다. 주식 솔루션 10 μl를 포함하는 단일 사용 유리병으로 나누어지는. 당신은 최대 9개월까지 -20 ° C에서 재고 솔루션을 저장할 수 있습니다. 해동 aliquots는 ° C 6주 필요한 경우 4 저장할 수 있지만, 해동 후 aliquots를 refreeze하지 않습니다.
   2. 준비하는 DNAse I 보육 혼합 10 μl DNAse I s의 RDD 70 μl 버퍼를 추가샘플마다 째깍 솔루션입니다. 부드러운 역전과 원심 분리기 튜브의 혼합 간략 잔여 액체 형태 튜브의 측면을 수집합니다. 직접 RNEasy 스핀 컬럼 80 μl DNAse I 보육 믹스를 추가합니다. 실온에서 30 분 DNAse 치료를 품어.
8. 다음 DNAse 치료는 상온에서 1 분 8,000 XG에서 스핀 컬럼 및 원심 분리기 350 μl 버퍼 RW1를 추가합니다.
9. 원심 분리는을 통해 흐름을 버리고 스​​핀 컬럼 500 μl 버퍼 RPE를 추가한 후. 상온에서 5 분 샘플을 품어.
10. 실온에서 1 분 8,000 XG에 샘플을 원심 분리기와를 통해 흐름을 폐기.
11. 원심 분리 후 스핀 컬럼 500 μl의 75 % 에탄올을 추가합니다.
12. 8,000 XG에서 원심 분리를 반복하지만, 상온에서 2 분.
13. 원심 분리는을 통해 흐름을 버리고 열에 5 분 동안 건조 후 수 있습니다.
14. 즉시 에탄올 성분 이상 남아를 제거하는 상온에서 5 분 8,000 XG에 원심 분리기.
15. 원심 분리 후 전송이 완료되었습니다는 새로운 1.5 ML 수집 관에 스핀 컬럼입니다 10 μl nuclease 무료 물을 추가합니다. 실온에서 1 분 10,000 XG에 원심 분리기 다음 1 분 부화합니다. RNA가 통과 흐름있을 것입니다.
16. 스핀 컬럼에 nuclease없는 물의 또 다른 10 μl를 추가하고 1 분 상온에서 알을 품다. 실온에서 1 분 10,000 XG에 샘플을 원심 분리기.
17. 원심 분리 후 제거하고 스핀 컬럼을 폐기. RNA는을 통해 흐름을있을 것입니다.
18. 제조 업체의 지침에 따라 NanoDrop ND - 1000 분광 광도계를 사용하여 RNA의 수량과 품질을 확인하십시오.
19. 또한, denaturing 젤을 실행하거나 RNA의 무결성을 확인하는 애질런트 2100 bioanalyzer을 사용합니다.
20. cDNA 합성을 수행할 수 있습니다 ° C까지 샘플은 -80에서 보관해야합니다.

파트 3 : Invitrogen 윗첨자 첫번째 - 스트랜드 시스템을 사용하여 cDNA 합성

RNA는 저하로 이어지는 RNAses에 의해 절단 쉽게 경향이있다. 결과적으로 많은 유전자 발현 프로토콜 직접 RNA로부터 합성되어보다 안정적인 cDNA 제품을 사용하기 위해 개발되었습니다. Invitrogen 어깨 첫번째 - 스트랜드 합성 시스템 ^3을 사용 처음 가닥 cDNA의 여기 상세 합성. 각 cDNA 합성 반응은 RNA의 5 μg 수용할 수 있습니다.

1. 프로 시저 믹스를 시작하기 전에하고 잠시 각각의 구성 요소를 원심 분리기.
2. 로 표 1에 명시된 멸균 0.5 ML의 microfuge 튜브에 RNA / 프라이머 혼합물을 준비합니다.
3. ° C 5 분 65 샘플을 품어.
4. 즉시 10 분 동안 얼음 슬러리에 샘플을 전송할 수 있습니다.
5. 예제는 표 2에 나와있는 구성 요소 마스터 믹스를 준비 냉각되는 동안. 볼륨은 1 반응 당 나열되어 있습니다. 반응의 총 개수에 대한 적절하게 볼륨을 조정합니다.
6. 냉각 후, 각각의 RNA / 프라이머 혼합물을 5 단계에서 준비한 마스터 믹스 9 μl를 추가합니다. 부드럽게 혼합 및 간단한 원심 분리하여 수집합니다. 각 샘플의 총 부피는 19 μl해야합니다.
7. thermocycler 2 분 42 ° C에서 샘플을 품어.
8. 각 튜브에 어깨 II RT 1 μl를 (50 세대) 추가 혼합하고, 42 품어 ° thermocycler 60 분 C.
9. 70 반응을 종료 후 15 분 ° C 4 ° C.에 냉기 샘플 thermocycler은 단계 8과 9 프로그래밍할 수 있습니다.
10. 샘플 4 ° C에 도달 후 얼음 목욕에 반응을 전송합니다.
11. 얼음에있는 각 튜브에 RNAse H 1 μl를 추가하고 37 20 분 동안 품어 ° C. 총 볼륨 이제 21 μl입니다. 샘플에 RNAse H의 추가는 RNA 템플릿을 저하만을 단일 가닥 cDNA 제품을 떠날 것입니다.

4 부 : cDNA 분리 및 강수량

1. 1.5 ML 위상 잠금 겔 튜브는 cDNA 제품의 절연에 사용됩니다. 2 분 동안 12,000 XG에서 원심 분리하여 1.5 ML 위상 잠금 겔 튜브를 준비합니다. 젤은 모든 튜브의 하단에 있어야합니다.
2. 위상 잠금 겔 튜브로 (21 μl), (트리스 - 포화 산도 8.0 버퍼) 81.5 μl 페놀 24:1 클로로포름 isoamyl 알콜의 81.5 μl, 그리고 샘플을 추가합니다. 부드러운 역전에 의해 여러 번 섞는다.
3. 실온에서 5 분간 12,000 XG에서 샘플을 원심 분리기.
4. cDNA는 위 수성 단계에 있어야합니다. 깨끗한 1.5 ML의 microfuge 관으로 상위 단계를 전송합니다. 총 부피는 20 μl 주위해야합니다.
5. 3 M NaOAc, 산도 5.2의 1X 볼륨을 추가하고 부드럽게 섞는다. 상단 수성 단계의 볼륨을 20 μl와 동일 경우 예를 들어, 3 M NaOAc, 산도 5.2 2 μl를 추가해야합니다.
6. 5 MG / ML 글리코겐 7 μl를 추가하고 부드럽게 섞는다.
7. 이소프로판올의 1X 볼륨을 추가하고 부드럽게 섞는다. 일반적으로이 주위에 이소프로판올 30 μl입니다.
8. 샘플 룸 temperatur에서 부화 허용다음 10 분 전자하고 실온에서 20 분 동안 12,000 XG에 원심 분리기.
9. 작은 cDNA 펠렛은 튜브의 바닥에 서식한다. 조심스럽게 피펫으로 뜨는을 제거합니다.
10. 70 % 에탄올과 역전의 믹스 500 μl를 추가합니다.
11. 5 분 12,000 XG에서 샘플을 원심 분리기.
12. 원심 분리는 피펫으로 뜨는을 제거하고 70 % 에탄올 세척 및 원심 분리를 (단계 10 11) 반복 후.
13. 원심 분리 후 피펫으로 뜨는을 제거합니다. 튜브의 측면에 남은 액체가있다면, 그것은 간단히 튜브를 회전하여 수집하실 수 있습니다. 초과 액체를 제거하고 펠릿 5 분 동안 상온에서 건조하실 수 있습니다.
14. 펠렛을 rehydrate하는 nuclease없는 물을 20 μl를 추가합니다. 펠렛의 rehydration 5 분 55 ° C에서 샘플을 놓으십시오.
15. cDNA 제품의 수량과 품질은 다음 제조 업체의 지침에 따라 NanoDrop ND - 1000 분광 광도계를 사용하여 검사합니다. cDNA는 -20 ° C.에 저장할 수 있습니다

대표 결과

RNA 정리 후,​​ 고품질의 총 RNA의 약 15 μg 50 zebrafish의 배아에서 기대하실 수 있습니다. 총 RNA 품질, 분광 광도계, 젤 전기 영동 및 애질런트 2100 Bioanalyzer을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. NanoDrop ND - 1000 분광 광도계는 280 nm의 (그림 1)에서 흡광도에 비해 260 nm의 흡광도에서를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. ₂₆₀ / ₂₈₀ 비율은 오염 물질의 존재를 공개 가능한 열화의 증거를 제공할 수 있습니다. ₂₆₀ / 1.9-2.0의 ₂₈₀ 비율 허용으로 간주됩니다. 또한, 그것은 매우 RNA의 변성 젤이 RNA의 무결성을 평가하기 위해 실행하는 것이 좋습니다. RNA의 가닥은 작은 가닥이 젤 아래 추가로 마이 그 레이션과 함께, 그들의 크기의 기준으로 구분됩니다. 비 저하 샘플 두 개의 강한 밴드와 얼룩으로 나타납니다. 얼룩은 서로 다른 크기의 mRNA의 가닥이 인구의 결과이며 밴드는 28S와 18S rRNA에 대응. 28S 밴드는 18S 밴드 (그림 2)에 대한 두 배나 강렬해야합니다. 또는, 총 RNA의 무결성 애질런트 2100 bioanalyzer를 사용하여 평가하실 수 있습니다. 28S와 18S rRNA를 나타내는 별개의 두 봉우리는 (그림 3) 예정입니다. 28S 피크는 봉우리 아래 면적 정상 18S 약 2시 1분, 각각보다 큰해야합니다. 별개의 두 봉우리가 저하 샘플에서 관찰되지 않습니다. 저하를 전시 RNA 샘플은 후속 실험 절차를 통해 수행해서는 안됩니다.

분광 분석은 cDNA 제품의 품질 (그림 4)을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. ₂₆₀ / ₂₈₀ 1.8 주변한다. 총 RNA의 5 μg의 입력과 cDNA 반응이 일상적으로 우리 연구실에 cDNA 제품 1-2 μg를 얻을 수 있습니다.

그림 1. RNA 샘플의 스펙트럼 NanoDrop. RNA 정리 후, RNA의 수량 및 품질은 NanoDrop ND - 1000 분광 광도계를 사용하여 평가하실 수 있습니다. 고품질의 전체 RNA의 약 15 μg는 정기적으로 1.9-2.0 주변 ₂₆₀ / _280의 비율로 50 zebrafish 배아에서 굴복이다.

그림 2. RNA의 변성 젤. 총 RNA 격리의 무결성을 평가하려면, RNA의 변성 젤을 실행하실 수 있습니다. 28S 및 18S rRNA에 대응하는이 밝은 밴드와 얼룩이 예상된다. 28S 밴드는 약 두 번 18S 밴드로 강렬한으로해야합니다.

그림 3. 총 RNA 격리의 무결성을 평가 bioanalyzer에서.하려면 RNA 샘플의 흔적은 샘플도 애질런트 2100 bioanalyzer에 분석할 수 있습니다. 28S와 18S rRNA의에 해당하는 두 개의 날카로운 봉우리는, 표시해야합니다. 28S 피크는 봉우리 아래 면적 정상 18S 약 2시 1분, 각각보다 큰해야합니다.

그림 4. cDNA 샘플의 스펙트럼 NanoDrop. NanoDrop ND - 1000과 분광 분석은 cDNA 제품의 수량과 품질을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. ₂₆₀ / ₂₈₀ 비율은 1.8 주위해야합니다. 총 RNA의 5 UG의 입력과 cDNA 반응이 일상적으로 우리 연구실에 cDNA 1-2 UG를 얻을 수 있습니다.

표 1. 구성 요소 cDNA 합성 단계 중 2 단계에서 RNA / 프라이머의 혼합물을 위해 추가할 수 있습니다.

구성 요소	음량
총 RNA (최대 5 μg)	10 μl
10 MM dNTP 믹스	1 μl
Oligo (DT) 12-18 (0.5 μg / μl)	1 μl
DEPC - 처리된 물	N의 μl
총 부피	10 μl

cDNA 합성 단계 5 표 2. 반응 혼합물. 나열된 볼륨 반응 당 수 있습니다. 반응의 총 개수에 대한 각 구성 요소의 볼륨을 높이십시오.

구성 요소	음량
10X RT 버퍼	2 μl
25 MM MgCl2	4 μl
0.1 MM DTT	2 μl
RNAseOUT	1 μl

토론

RNA 분자의 취약성이 프로토콜을 통해 기억되어야하는 가장 중요한 고려 사항이다. RNAse - 무료 살균 장비는 항상 연구실의 RNAse없는 영역에서 사용해야합니다. 단 RNA 절차에 사용하는 실험실의 일부를 예약하는 것이 도움이 그것입니다. 이 지역은 자주 자리 비움 같은 RNAse으로 RNAse 제거 제품과 뿌렸해야합니다. RNA 샘플은 항상 장갑을 착용 한채로 처리하고 저하를 방지하기 위해 얼음에 보관해야?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycogen (5 mg/ml)	Ambion	9510
NanoDrop ND-100	Thermo Fisher Scientific, Inc.	ND-1000
Pellet Pestles with Microfuge Tube	VWR international	KT749520-0090
Phase Lock Gel Light, 1.5 ml	Eppendorf	2302800
Phenol, Tris-saturated	Roche Group	3117944001
RNAse Away	VWR international	17810-491
RNAse-Free DNase Set	Qiagen	79254
RNEasy Mini Kit	Qiagen	74104
SuperScript® First-Strand Synthesis System for RT-PCR	Invitrogen	11904-018
TRIzol	Invitrogen	15596-026