La ligadura cecal punción

Resumen

El modelo de ratón de la ligadura y punción cecal como una herramienta valiosa para el estudio de la sepsis humana.

Resumen

Sepsis humana se caracteriza por un conjunto de reacciones sistémicas en respuesta a la infección intensiva y masiva que no pudo ser contenida a nivel local por el anfitrión. En la actualidad, ocupa la sepsis entre las diez primeras causas de mortalidad en las unidades de cuidados intensivos EE.UU. ^1. Durante la sepsis hay dos fases establecidas hemodinámicos que pueden solaparse. La fase inicial (hiperdinámico) se define como una producción masiva de citoquinas proinflamatorias y especies reactivas de oxígeno por los macrófagos y neutrófilos que afecta a la permeabilidad vascular (que conduce a hipotensión), la función cardiaca e induce cambios metabólicos que culminó en la necrosis tisular y fallo multiorgánico. En consecuencia, la causa más común de mortalidad es la insuficiencia renal aguda. La segunda fase (hypodynamic) es un proceso anti-inflamatorio que implica la presentación de antígeno alterado monocitos, disminución de la proliferación de linfocitos y la función y aumento de la apoptosis. Este estado se conoce como inmunosupresión o inmunodepresión aumenta drásticamente el riesgo de infecciones nocosomial y finalmente la muerte,. Los mecanismos fisiopatológicos de estos procesos no están bien caracterizadas. Debido a que las dos fases de la sepsis puede causar daños irreversibles e irreparables, es esencial para determinar el estado inmunológico y fisiológico del paciente. Esta es la razón principal por la que muchas drogas terapéuticas han fracasado. La misma droga dada en las diferentes etapas de la sepsis puede ser terapéutico o dañinas o no tener efecto ^2,3. Para entender la sepsis en los distintos niveles es fundamental contar con un modelo animal adecuado y completo que reproduce el curso clínico de la enfermedad. Es importante para caracterizar los mecanismos fisiopatológicos que se producen durante la sepsis y el control de las condiciones del modelo para las pruebas de potenciales agentes terapéuticos.

Para el estudio de la etiología de la sepsis humana investigadores han desarrollado diferentes modelos animales. El modelo más utilizado es la ligadura de clínica y punción cecal (CLP). El modelo CLP consiste en la perforación del ciego que permita la liberación de material fecal en la cavidad peritoneal para generar una respuesta inmune exacerbada inducida por la infección polimicrobiana. Este modelo cumple con la condición humana que es clínicamente relevante. Al igual que en los seres humanos, los ratones que sufren CLP con la reanimación con líquidos muestran la primera (temprana) fase hiperdinámica que con el tiempo avanza a la segunda (tardía) de fase hypodynamic. Además, el perfil de citoquinas es similar a la observada en la sepsis humana, donde hay una mayor apoptosis de los linfocitos (revisado en ^4,5). Debido a los múltiples mecanismos involucrados y la superposición en la sepsis, los investigadores necesitan un modelo de sepsis adecuada de la gravedad de control a fin de obtener resultados consistentes y reproducibles.

Protocolo

1. La ligadura y punción cecal como un modelo de ratón para la sepsis humana

Para este procedimiento de C57BL / 6 ratones (7-9 semanas de edad) se utilizan.

1. Anestesiar a los ratones mediante la inyección intraperitoneal de una solución de 1:01 de ketamina (75mg/kg) y xilazina (15mg/kg). Como referencia, se inyectan 30 ul de la solución de 1:1 en un ratón de 20 gramos. Por otra parte, los ratones pueden ser anestesiados con isoflurano inhalado usando un vaporizador de anestesia.
2. Afeitarse el abdomen del ratón y desinfectar la zona por la primera solución de betadine seguido aplicando la limpieza con un hisopo de alcohol al 70% (el número 1 en la secuencia de imágenes a continuación). La clorhexidina puede ser utilizado como un antiséptico alternativo. Opcional: un campo estéril puede ser usado para mantener el área limpia.
3. En condiciones asépticas, la práctica de un 1 a 2 cm laparotomía media y exponer el ciego con el intestino adyacente (2 y 3).
4. El ciego está estrechamente ligado con una sutura de seda 6.0 (6-0 PROLENE, 8680G, Ethicon) en su base por debajo de la válvula íleo-cecal, y se perfora una o dos veces con una aguja de calibre 19 (4 y 5) en el mismo lado del ciego. Tenga en cuenta que la longitud del ciego ligado define como la distancia desde el extremo distal del intestino ciego a punto de ligadura determinará el grado de severidad. Una distancia de> 1 cm produce sepsis de alto grado, mientras que una distancia de 1 cm ≤ produce entre mediados y bajo grado de sepsis. También tenga en cuenta que el método de perforación cecal se muestra aquí es diferente de la norma a través y mediante la técnica de punción (la introducción de una aguja a través del ciego). Ambos métodos fiable producir el resultado sepsis mismo. Sin embargo, una desventaja de la técnica hasta la médula, es que no facilita el control de la cantidad de heces extrusión cuando el ciego se aprieta.
5. El ciego es entonces apretó suavemente para extruir una pequeña cantidad de heces de los sitios de perforación (6). El ciego es devuelto a la cavidad peritoneal y el peritoneo se cierra con 6,0 puntos de seda. (7).
6. La piel se cierra con Reflex clips 7mm (RS-9258, Instrumentos Roboz quirúrgica) o clips de Michel herida (7 mm, RS-9270) (8).
7. Resucitar ratones mediante la inyección subcutánea de 1 ml de solución pre-calentado 0,9% utilizando una aguja 25G. Esta medida la reanimación con líquidos se induce la fase hiperdinámica de la sepsis. Este paso fundamental se describe con detalle en la sección de discusión.
8. Opcional: Se inyecta por vía subcutánea con buprenorfina (0,05 mg / kg de peso corporal) o tramadol (20mg/kg de peso corporal) para la analgesia postoperatoria. Tenga en cuenta que estos opiáceos puede suprimir la respiración y la locomoción, y estos efectos pueden ser mal interpretados como signos de sepsis.
9. Los animales se colocan temporalmente en un cojín eléctrico o, alternativamente, regresó de inmediato a una jaula con la exposición a una lámpara de calefacción por infrarrojos de 150 W hasta que se recupere de la anestesia. El tiempo de recuperación es de 30 minutos a 1 hora.
10. Proporcionar acceso libre a comida y agua (hidrogel) colocado en la parte inferior de la jaula.
11. Los ratones son monitoreados cada 12 horas para la supervivencia de una a dos semanas o la eutanasia en diferentes puntos temporales para el análisis de diferentes parámetros.

Como el control para el diseño experimental, los animales sham seguiría la técnica de laparotomía sin ligadura y punción.
De seis a 12 horas después del procedimiento quirúrgico los ratones se convertirá en letargo y fiebre, piloerección, diarrea, acurrucándose, y malestar general, todos los síntomas de la sepsis. Los ratones con sepsis severa apenas se puede mover antes de la muerte y muestran una disminución drástica de la temperatura corporal. En este paso los ratones deben ser sacrificados para evitar el dolor y el sufrimiento prolongado.

2. Parámetros analizados más comunes

Para evaluar el resultado del procedimiento, los diferentes parámetros se pueden analizar en los órganos, extractos de células o fluidos corporales. Las muestras se pueden recoger en diferentes puntos de tiempo de 3 horas a una semana después del procedimiento quirúrgico.

1. Los ratones de supervivencia.
2. Citocinas y quimiocinas en la cavidad del suero, peritoneal y extractos de órganos.
   1. La interleucina-6: Producido y publicado por los monocitos, células dendríticas, macrófagos, células B, células T, granulocitos, células cebadas y muchos más tipos de células. Desempeña un papel importante en la reacción de fase aguda y la inflamación.
   2. Factor de necrosis tumoral α: citoquinas Pleiotrophic que juega un papel central en la inflamación y la apoptosis. Producida por los monocitos, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas y fibroblastos.
   3. nterleukin-1β: Producida por los monocitos, células NK, células dendríticas, las células B y células T. Induce fiebre y la síntesis de proteínas de fase aguda.
   4. IL-10: Promueve la absorción de fagocitosis y las respuestas Th2, pero suprime la Antigen la presentación y las respuestas Th1 proinflamatorias.
   5. IL-10: Promueve la absorción de fagocitosis y las respuestas Th2, pero suprime la presentación de antígenos y las respuestas Th1 proinflamatorias.
   6. Monocitos quimiotaxis proteína-1 (también conocida como CCL2): Los reclutas monocitos, células T de memoria, y las células dendríticas a los sitios de lesión tisular y la infección.
   7. KC (CXCL1): Producido por los macrófagos y las células endoteliales. Ratón KC es un atrayente de neutrófilos potente y activador.
   8. RANTES: A quimiotáctica de monocitos. Puede chemoattract CD4 + estimuladas / CD45RO + células T de memoria y CD4 + estimuladas y células T CD8 + con ve na y los fenotipos de la memoria.
   9. El interferón-γ: secretada por las células Th1, células T citotóxicas, células dendríticas y células asesinas naturales (NK). Aumenta la presentación del antígeno y actividad lítica de los macrófagos y suprime la actividad de las células Th2. Promueve la adhesión y la unión necesaria para la migración de leucocitos y promueve la actividad de las células NK.
   10. Alta movilidad del grupo B-1 de proteína: En los monocitos es un factor nuclear kappa B activador de la unión al receptor celular para productos avanzados de la glicación (RAGE), la activación de la liberación de mediadores proinflamatorios en la fase tardía de la sepsis.
3. Mieloperoxidasa en los órganos de decisión como una medida de la infiltración de neutrófilos. Mieloperoxidasa (MPO) es una enzima peroxidasa de la mayoría de los presentes en abundancia en los granulocitos neutrófilos. Es una proteína lisosomal almacenada en los gránulos azurófilos de los neutrófilos. MPO tiene un pigmento hemo, lo que hace que su color verde en las secreciones ricas en neutrófilos, como pus y algunos tipos de moco.
4. Las bacterias de carga en los órganos y sangre, medida como el número de unidades formadoras de colonias por mililitro.

3. Resultados representante

El procedimiento de CLP se realizó inicialmente en la cepa de ratón C57BL / 6. Hemos probado varios parámetros para modular la gravedad de la sepsis mediante la alteración de la longitud de la ligadura y el grosor de la aguja, como se muestra en las figuras 1 y 2. Entre estos dos factores, la longitud de la ligadura parece ser más eficaz que el grosor de la aguja para modificar el porcentaje de supervivencia. Como se muestra en la Figura 1, el aumento de la longitud de la ligadura por más de 1 cm provoca un aumento de la mortalidad del 100% en comparación con los ratones con una ligadura de ≤ 1 cm. El aumento del grosor de la aguja también se redujo el porcentaje de supervivencia de 100% (con una aguja 22G) al 55% (utilizando una aguja 19G) con dos pinchazos. También hemos probado el efecto de la CLP en C57BL / 6 y ratones 129SvJ para determinar si las diferentes cepas de ratón presentan una sensibilidad similar o distinta a CLP inducida por sepsis. La Figura 3 muestra que en las mismas condiciones, los ratones 129SvJ eran más susceptibles a la infección que C57BL / 6, indicado por un mayor porcentaje de mortalidad.

Figura 1. Efecto de la longitud de la ligadura del ciego en la supervivencia del animal. CLP se realizó en ratones C57BL / 6 con dos longitudes de ligadura cecal. Este parámetro solo afecta dramáticamente la supervivencia de los animales, ya que todos los animales en el grupo con un área de la ligadura de más de 1 cm murió en menos de 3 días en comparación con un grupo de animales que tienen un área de la ligadura de 1 cm aprox. (N = 8).

Figura 2. Influencia de grueso de la aguja en la supervivencia. CLP se realizó en ratones C57BL / 6 con dos tamaños de aguja, 19G y 22G. Los ratones con el ciego perforado con una aguja 19G mostraron una supervivencia de 55-60%. En contraste, los ratones con el ciego perforado con una aguja 22G mostró 100% de supervivencia a pesar de que experimentó los síntomas típicos de la inflamación durante los primeros 3-4 días, que desapareció después de 4 días (n = 8).

Figura 3. La comparación de la susceptibilidad sepsis entre dos diferentes cepas de ratón. El modelo CLP se realizó en 129SvJ y C57BL 6 / en las mismas condiciones. Al final del periodo de evaluación el porcentaje de supervivencia de la cepa 129SvJ fue un 25% menos que en la cepa C57BL / 6, lo que indica una mayor susceptibilidad a la inflamación inducida por la infección polimicrobiana. (N = 6).

Discusión

Aquí se muestra en detalle cómo llevar a cabo el modelo de CLP en ratones y modular el grado de severidad.

En comparación con otros modelos animales de sepsis, CLP se puede realizar en cualquier cepa de ratones de diferentes edades y sexo. Es un procedimiento quirúrgico relativamente fácil y barato. En este modelo, el grado de severidad tiene un impacto directo en el porcentaje de supervivencia. La longitud de la ligadura, el grosor de la aguja y el número de punciones son parámetros ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
La ketamina	Ketaset	0856-2013-01
Xilazina	AnaSed	NADA # 139-236
29G jeringa de insulina	Exel	26028
Sutura de seda, 6-0 PROLENE *	Ethicon	8680G
Aguja 19G y 25G	BD	305186
Maquinilla de afeitar	Generales de suministro	Generales de suministro
Lámpara de calefacción por infrarrojos	Generales de suministro	Generales de suministro
Michel herida clips 7mm	Roboz quirúrgica Instr	RS-9270
Oído lazo Máscara	Fisher Scientific	19-130-4181
Tijeras de disección	Roboz quirúrgica Instr	RS-6702
Betadine solución	VWR	63410-992
Fórceps quirúrgicos	Roboz quirúrgica Instr	RS-5135
70% algodón con alcohol isopropílico	Fisher Scientific	22-031-350
La buprenorfina	Bedford Laboratorios	55390-100-10
Tramadol	Sigma-Aldrich	42965