Слепой кишки Процедура прокола Лигирование

Резюме

Мышиной модели слепой кишки перевязки и проколы, как ценным инструментом для изучения человеческих сепсиса.

Аннотация

Human sepsis is characterized by a set of systemic reactions in response to intensive and massive infection that failed to be locally contained by the host. Currently, sepsis ranks among the top ten causes of mortality in the USA intensive care units ¹. During sepsis there are two established haemodynamic phases that may overlap. The initial phase (hyperdynamic) is defined as a massive production of proinflammatory cytokines and reactive oxygen species by macrophages and neutrophils that affects vascular permeability (leading to hypotension), cardiac function and induces metabolic changes culminating in tissue necrosis and organ failure. Consequently, the most common cause of mortality is acute kidney injury. The second phase (hypodynamic) is an anti-inflammatory process involving altered monocyte antigen presentation, decreased lymphocyte proliferation and function and increased apoptosis. This state known as immunosuppression or immune depression sharply increases the risk of nocosomial infections and ultimately, death. The mechanisms of these pathophysiological processes are not well characterized. Because both phases of sepsis may cause irreversible and irreparable damage, it is essential to determine the immunological and physiological status of the patient. This is the main reason why many therapeutic drugs have failed. The same drug given at different stages of sepsis may be therapeutic or otherwise harmful or have no effect ^2,3. To understand sepsis at various levels it is crucial to have a suitable and comprehensive animal model that reproduces the clinical course of the disease. It is important to characterize the pathophysiological mechanisms occurring during sepsis and control the model conditions for testing potential therapeutic agents.

To study the etiology of human sepsis researchers have developed different animal models. The most widely used clinical model is cecal ligation and puncture (CLP). The CLP model consists of the perforation of the cecum allowing the release of fecal material into the peritoneal cavity to generate an exacerbated immune response induced by polymicrobial infection. This model fulfills the human condition that is clinically relevant. As in humans, mice that undergo CLP with fluid resuscitation show the first (early) hyperdynamic phase that in time progresses to the second (late) hypodynamic phase. In addition, the cytokine profile is similar to that seen in human sepsis where there is increased lymphocyte apoptosis (reviewed in ^4,5). Due to the multiple and overlapping mechanisms involved in sepsis, researchers need a suitable sepsis model of controlled severity in order to obtain consistent and reproducible results.

протокол

1. Лигирование слепой кишки и прокол, как мышь Модель по правам Сепсис

Для этой процедуры C57BL / 6 мышей (7-9 недель) используются.

1. Анестезию мыши путем введения внутрибрюшинно раствор 1:1, кетамина (75mg/kg) и ксилазина (15мг/кг). В качестве примера можно вводить 30 мкл раствора в 1:01 мышь весом 20 граммов. Кроме того, мышь может быть анестезии ингаляционными изофлуран использования испарителя анестетиков.
2. Бритье брюшко мыши и дезинфекции области, первое применение бетадин решение следует вытирая с 70% спиртом (номер 1 на рисунке последовательности ниже). Хлоргексидин может быть использован как альтернативный антисептиком. Дополнительно: стерильный драпировка может быть использована для поддержания в чистоте.
3. В асептических условиях, практика 1 до 2 см срединной лапаротомии и подвергать слепой кишки с прилегающей кишечника (2 и 3).
4. Слепая кишка плотно лигировали с 6,0 шелковых шва (6-0 PROLENE, 8680G; Ethicon) на его базе ниже подвздошно-слепой кишки клапан, и перфорированные один или два раза с 19-иглы (4 и 5) на том же стороны слепой кишки. Пожалуйста, обратите внимание, что длина лигируют слепой кишки определяется как расстояние от дистального конца слепой кишки перевязки точка будет определять степень тяжести. Расстоянии> 1 см производит высококачественных сепсисом при расстоянии ≤ 1 см производит средне-и низкосортных сепсиса. Также обратите внимание, что использование метода слепой кишки перфорация, показанный здесь, отличается от стандартного насквозь проколов техника (введение иглы через слепой кишки). Оба способа надежно производить тот же исход сепсиса. Однако один недостаток техники насквозь том, что она не способствует регулирования количества кала экструдированного, когда слепая кишка сжимается.
5. Слепая кишка затем мягко сжала чтобы выдавить небольшое количество кала от перфорации сайтов (6). Слепая кишка возвращается в брюшную полость и брюшины закрыта с 6,0 швов шелка. (7).
6. Кожа закрыта с 7 мм клипы Reflex (RS-9258, Roboz Хирургические инструменты) или Мишель раны клипов (7 мм, RS-9270) (8).
7. Resuscitate мышей путем введения подкожно 1 мл подогретого 0,9% солевого раствора с использованием 25G иглу. Эта жидкость мера реанимации будет побуждать гипердинамического фазы сепсиса. Это важный шаг описан далее в разделе обсуждения.
8. Дополнительно: Inject подкожно бупренорфин (0.05mg / кг массы тела) или трамадола (20mg/kg массы тела) для послеоперационного обезболивания. Имейте в виду, что эти опиатов может подавлять дыхание и передвижения, и эти эффекты могут быть ошибочно интерпретированы как признаки сепсиса.
9. Животные размещаются временно на грелку или же немедленно возвращены в клетку с воздействием инфракрасной лампой нагрева 150W, пока они не оправиться от наркоза. Время восстановления составляет от 30 мин до 1 часа.
10. Обеспечить свободный доступ к пище и воде (гидрогель), размещенные на дно клетки.
11. Мыши контролируются каждые 12 часов за выживание в течение одного-двух недель или эвтаназии в различные моменты времени для анализа различных параметров.

В качестве контрольных для опытно-конструкторских, шам животных будут следовать лапаротомии технику без перевязки и пункции.
От шести до 12 часов после хирургического мышей процедуры станут вялыми и развитие лихорадки, пилоэрекции, диарея, сбившись, и недомогание, и все признаки сепсиса. Мыши с очень тяжелым сепсисом едва ли могут двигаться до смерти и демонстрируют резкое снижение температуры тела. На данном этапе мышам должны быть умерщвлены, чтобы избежать длительной боли и страданий.

2. Наиболее распространенные анализируемых параметров

Для оценки результатов процедуры, различные параметры могут быть проанализированы в органах, клеточных экстрактов или другими биологическими жидкостями. Образцы могут быть собраны в различные моменты времени от 3 часов до одной недели после хирургического вмешательства.

1. Мыши выживания.
2. Цитокины и хемокинов в сыворотке крови, брюшной полости и органов экстрактов.
   1. Интерлейкина-6: Производство и выпущен моноциты, дендритные клетки, макрофаги, В-клетки, Т-лимфоциты, гранулоциты, тучные клетки и многие другие типы клеток. Он играет важную роль в фазу острой реакции и воспаление.
   2. Фактор некроза опухоли-α: Pleiotrophic цитокина, который играет центральную роль в воспалении и апоптоза. Подготовлено моноциты, макрофаги, нейтрофилы, дендритные клетки и фибробласты.
   3. nterleukin-1β: Продюсеры моноциты, НК-клетки, дендритные клетки, В-клетки и Т-клеток. Вызывает лихорадку и синтез белков острой фазы.
   4. Интерлейкин 10: Способствует фагоцитарной поглощения и Th2 ответа, но подавляет antigан презентации и провоспалительных Th1 ответа.
   5. Интерлейкин 10: Способствует фагоцитарной поглощения и Th2 ответа, но подавляет презентации антигена и провоспалительных Th1 ответа.
   6. Моноцитарный хемотаксиса белка-1 (также известный как CCL2): Новобранцы моноциты, ячеек памяти T, и дендритные клетки к местам повреждения тканей и инфекции.
   7. KC (CXCL1): Продюсер макрофаги и эндотелиальные клетки. Мышь KC является мощным аттрактанта нейтрофилов и активатор.
   8. RANTES: моноцитов хемоаттрактант. Он может chemoattract нестимулированных CD4 + / CD45RO + Т-клеток памяти и стимулировало CD4 + и CD8 + Т-клеток с наивны и памяти фенотипы.
   9. Интерферон-γ: выделяемый Th1 клеток, цитотоксических Т-лимфоцитов, дендритных клеток и естественных киллеров (НК) клетки. Увеличивает презентации антигена и литической активности в макрофагах и подавляет активность клеток Th2. Способствует адгезии и обязательным, необходимые для миграции лейкоцитов и способствует активности клеток NK.
   10. Высокая мобильность группы В-1 белка: в моноцитов является ядерного фактора каппа-B активатора путем связывания с клеточным рецептором для продвижения гликирования конечных продуктов (RAGE), активизируя высвобождение провоспалительных медиаторов в поздней стадии сепсиса.
3. Миелопероксидаза определения в органах в качестве меры нейтрофилов инфильтрации. Миелопероксидазы (МПО) является ферментом пероксидазой наиболее обильно присутствующие в нейтрофильных гранулоцитов. Это лизосомальных белков, хранящихся в азурофильных гранул нейтрофилов. МРО гема пигмент, который вызывает его в зеленый цвет выделений богат нейтрофилов, таких как гной и некоторые формы слизи.
4. Бактерии нагрузки в органах и крови, измерить как количество колониеобразующих единиц на миллилитр.

3. Представитель Результаты

Процедура CLP изначально производится в штамм мыши C57BL / 6. Мы протестировали несколько параметров для модуляции тяжести сепсиса, изменяя длину труб и толщина иглы как показано на рисунках 1 и 2. Среди этих факторов, но длина перевязки, кажется, более эффективным, чем толщина иглы изменить процент выживания. Как показано на рисунке 1, увеличение длины перевязки более чем на 1 см провоцирует рост смертности на 100% по сравнению с мышами, имеющие перевязки ≤ 1см. Увеличение толщины иглы также снизился процент выживаемости с 100% (с помощью иглы 22G) до 55% (с помощью иглы 19G) с двумя проколами. Мы также проверили влияние на CLP C57BL / 6 и 129SvJ мышей для определения различных линий мышей дисплей аналогичных или различных восприимчивость к CLP-индуцированной сепсисом. Рисунок 3 показывает, что при тех же условиях, 129SvJ мышей были более восприимчивы к инфекции, чем C57BL / 6, свидетельствует увеличение смертности процентов.

Рисунок 1. Влияние перевязки длина слепой кишки на животных выживание. CLP был выполнен в C57BL / 6 мышей с использованием двух различных длин слепой кишки труб. Это единственный параметр существенно влияет на выживаемость животных, так как все животные в группе с перевязкой площадь более 1 см умер менее чем за 3 дня по сравнению с группой животных, имеющих перевязки площадью 1 см прим. (П = 8).

Рисунок 2. Влияние толщины иглы на выживание. CLP был выполнен в C57BL / 6 мышей с использованием двух различных размеров иглы 19G и 22G. Мыши с использованием перфорированной слепой кишки 19G иглу показали 55-60% выживаемости. В отличие от мышей с использованием перфорированных слепой кишки 22G иглу показали 100% выживаемости, хотя они испытывали типичные симптомы воспаления в течение первых 3-4 дней, которые исчезли после 4 дней (п = 8).

Рисунок 3. Сравнение сепсис восприимчивости между двумя различными штаммами мыши. Модель CLP был выполнен в 129SvJ и C57BL / 6, на тех же условиях. В конце периода оценки процент выживания 129SvJ штамм был на 25% меньше, чем в C57BL / 6, напряжение, что указывает на более высокую восприимчивость к воспалению индуцированных полимикробная инфекции. (П = 6).

Обсуждение

Здесь мы подробно показать, как выполнить модель CLP у мышей и модулировать степени тяжести.

По сравнению с другими моделями животных сепсиса, CLP могут быть выполнены в любой мыши штамма разного возраста и пола. Это относительно простой и недорогой хирургической операции....

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
Кетамин	Ketaset	0856-2013-01
Ксилазин	AnaSed	NADA # 139-236
29G инсулина шприц	Exel	26028
Шелковая нить, 6-0 PROLENE	Ethicon	8680G
19G и 25G иглы	BD	305186
Бритва	Генеральный питания	Генеральный питания
Инфракрасные лампы Отопление	Генеральный питания	Генеральный питания
Мишель раны клипы 7мм	Roboz Хирургическое Instr	RS-9270
Ухо Loop маски	Fisher Scientific	19-130-4181
Препарирование ножницы	Roboz Хирургическое Instr	RS-6702
Бетадин раствор	VWR	63410-992
Хирургические щипцы	Roboz Хирургическое Instr	RS-5135
70% изопропиловый спирт площадку	Fisher Scientific	22-031-350
Бупренорфин	Бедфорд Labs	55390-100-10
Трамадол	Sigma-Aldrich	42965