Procedimento de punção cecal Ligadura

Resumo

O modelo do rato de ligadura e punção cecal como uma ferramenta valiosa para o estudo da sepse humana.

Resumo

Sepse humana é caracterizada por um conjunto de reações sistêmicas em resposta à infecção intensivo e massivo que não conseguiu ser contido localmente pelo anfitrião. Atualmente, ocupa o sepse entre os dez maiores causas de mortalidade nas unidades de terapia intensiva EUA ^1. Durante a sepse, há duas fases estabelecidas hemodinâmicas que podem se sobrepor. A fase inicial (hiperdinâmico) é definido como uma produção maciça de citocinas pró-inflamatórias e espécies reativas de oxigênio por macrófagos e neutrófilos, que afeta a permeabilidade vascular (levando à hipotensão), a função cardíaca e induz a alterações metabólicas, culminando com necrose de tecidos e falência de órgãos. Consequentemente, a causa mais comum de mortalidade é lesão renal aguda. A segunda fase (hipodinâmicos) é um processo anti-inflamatório envolvendo apresentação de antígenos alterados monócitos, diminuição da proliferação de linfócitos e função e aumento da apoptose. Este estado conhecido como imunossupressão ou depressão imunológica aumenta consideravelmente o risco de infecções nocosomial e, finalmente, a morte. Os mecanismos destes processos fisiopatológicos não estão bem caracterizados. Porque ambas as fases da sepse pode causar danos irreversíveis e irreparáveis, é essencial para determinar o estado imunológico e fisiológicas do paciente. Esta é a principal razão pela qual muitas drogas terapêuticas falharam. A mesma droga dada em diferentes estágios de sepse pode ser terapêutico ou de outra forma prejudicial ou não têm nenhum efeito ^2,3. Para entender sepse em vários níveis é fundamental para ter um modelo animal adequado e abrangente, que reproduz o curso clínico da doença. É importante caracterizar os mecanismos fisiopatológicos que ocorrem durante a sepse e controlar as condições do modelo para testar potenciais agentes terapêuticos.

Para estudar a etiologia da sepse humana pesquisadores desenvolveram diferentes modelos animais. O modelo mais utilizado é a ligadura cecal clínicos e punção (CLP). O modelo CLP consiste na perfuração do ceco permitindo a liberação de material fecal na cavidade peritoneal para gerar uma resposta exacerbada imune induzida por infecção polimicrobiana. Este modelo cumpre a condição humana que é clinicamente relevante. Como em humanos, ratos que passam por CLP com reposição volêmica mostram a fase (início), primeiro hiperdinâmica que com o tempo progride para a fase (final) segundo hipodinâmicos. Além disso, o perfil de citocinas é semelhante ao observado na sepse humana, onde há aumento da apoptose de linfócitos (revisto em ^4,5). Devido aos mecanismos de múltiplas e sobrepostas envolvidos na sepse, os pesquisadores precisam de um modelo adequado de gravidade da sepse controlada a fim de obter resultados consistentes e reprodutíveis.

Protocolo

1. Ligadura cecal e punção como um modelo de camundongo para Sepsis Humanos

Para este procedimento C57BL / 6 ratos (7-9 semanas de idade) são utilizados.

1. Anestesiar o rato pela injeção intraperitoneal de uma solução de 1:1 de quetamina (75mg/kg) e xilazina (15mg/kg). Como referência, injetar 30 mL da solução de 1:01 em um rato pesando 20 gramas. Alternativamente, os camundongos podem ser anestesiados com isoflurano inalado através de um vaporizador anestésico.
2. Raspar o abdome do rato e desinfectar área pela solução betadine primeira aplicação seguido por limpeza com uma gaze com álcool 70% (número 1 na seqüência imagem abaixo). Clorexidina pode ser utilizada como um anti-séptico alternativa. Opcional: uma cortina estéril pode ser usada para manter a área limpa.
3. Sob condições assépticas, uma prática 1 a 2 cm laparotomia mediana e expor o ceco com intestino adjacente (2 e 3).
4. O ceco é firmemente ligada com um fio de seda 6.0 (6-0 PROLENE, 8680G, Ethicon) em sua base abaixo da válvula íleo-cecal, e é perfurado uma ou duas vezes com uma agulha de calibre 19 (4 e 5) na mesma lado do ceco. Por favor, note que o comprimento do ceco ligada definido como a distância entre a extremidade distal do ceco ao ponto de ligadura vai determinar o grau de severidade. A distância de> um centímetro produz sepse de alta qualidade, enquanto uma distância de 1 cm ≤ produz meio-de-baixo grau sepse. Observe também que utilizando o método de perfuração cecal mostrado aqui é diferente do padrão através de e através da técnica de punção (introdução de uma agulha através do ceco). Ambos os métodos de produzir o resultado confiável sepse mesmo. No entanto, uma desvantagem da técnica de ponta a ponta é que não facilita controlar a quantidade de fezes extrudados quando o ceco é espremido.
5. O ceco é, então, pressiona suavemente para expulsar uma pequena quantidade de fezes dos locais de perfuração (6). O ceco é retornado para a cavidade peritoneal e peritônio é fechado com 6,0 suturas de seda. (7).
6. A pele é fechada com grampos Reflex 7mm (RS-9258, Instrumentos Cirúrgicos Roboz) ou grampos de sutura Michel (7 mm, RS-9270) (8).
7. Ressuscitar ratos através da injeção por via subcutânea 1 ml de solução pré-aquecido 0,9% com uma agulha de 25G. Esta medida fluidoterapia irá induzir a fase hiperdinâmica da sepse. Este passo crítico é descrito mais adiante na seção de discussão.
8. Opcional: Inject por via subcutânea buprenorfina (0,05 mg / kg de peso corporal) ou tramadol (20mg/kg peso corporal) para analgesia pós-operatória. Ser advertidos de que estes opiáceos pode suprimir a respiração e locomoção e estes efeitos podem ser interpretados como sinais de sepsis.
9. Os animais são colocados temporariamente em uma almofada de aquecimento ou, alternativamente, voltou imediatamente para uma gaiola com a exposição a uma lâmpada de aquecimento infravermelho de 150W, até que se recuperar da anestesia. O tempo de recuperação é de 30 min a 1 hora.
10. Fornecer acesso livre à comida e água (hidrogel) colocado no fundo da gaiola.
11. Ratos são monitorados a cada 12 horas para a sobrevivência de uma a duas semanas ou eutanásia em momentos diferentes para análise de parâmetros diferentes.

Como controle para o projeto experimental, os animais sham iria seguir a técnica de laparotomia sem ligadura e punção.
Seis a 12 horas após o procedimento cirúrgico os ratos se tornarão letárgicos e desenvolver febre, piloereção, diarréia, encolhendo-se, mal-estar e, todos os sintomas de sepse. Camundongos com sepse grave muito mal consegue se mover antes da morte e exibem uma diminuição drástica da temperatura corporal. Neste ratos etapa deve ser sacrificados para evitar a dor e sofrimento prolongado.

2. Mais comuns Parâmetros Analisados

Para avaliar o resultado do procedimento, diversos parâmetros podem ser analisados ​​em órgãos, extratos celulares ou fluidos corporais. Amostras podem ser coletadas em momentos diferentes de 3 horas para uma semana após o procedimento cirúrgico.

1. Sobrevivência camundongos.
2. Citocinas e quimiocinas na cavidade, soro peritoneal e extratos de órgãos.
   1. Interleucina-6: Produzido e lançado por monócitos, células dendríticas, macrófagos, células B, células T, granulócitos, mastócitos e tipos de células muito mais. Ela desempenha um papel importante na reação de fase aguda e inflamação.
   2. Fator de necrose tumoral α: Pleiotrophic citocina que desempenha um papel central na inflamação e apoptose. Produzido por monócitos, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas e fibroblastos.
   3. nterleukin-1β: Produzido por monócitos, células NK, células dendríticas, células B e células T. Induz febre e síntese de proteínas de fase aguda.
   4. Interleucina 10: Promove a absorção fagocíticas e Th2, mas suprime antigen apresentação e respostas Th1 pró-inflamatórias.
   5. Interleucina 10: Promove a absorção fagocíticas e Th2, mas suprime a apresentação de antígenos e respostas Th1 pró-inflamatórias.
   6. Monócitos quimiotáticos proteína-1 (também conhecido como CCL2): Recrutas monócitos, células T de memória e células dendríticas aos locais de lesão tecidual e infecção.
   7. KC (CXCL1): Produzido por macrófagos e células endoteliais. KC rato é um atrativo de neutrófilos potente e ativador.
   8. RANTES: A quimiotática de monócitos. Pode chemoattract CD4 unstimulated + / CD45RO + células de memória T CD4 e estimulado + e CD8 + T com nd ve e fenótipos de memória.
   9. Interferon-γ: Secretada por células Th1, células T citotóxicas, células dendríticas e natural killer (NK). Aumenta a apresentação de antígenos e atividade lítica de macrófagos e suprime a atividade das células Th2. Promove a adesão e de ligação necessários para a migração de leucócitos e promove a atividade das células NK.
   10. Alta mobilidade do grupo B-1 de proteínas: No monócitos é um fator nuclear kappa B ativador pela ligação ao receptor celular para produtos de glicação antecedência final (RAGE), ativando a liberação de mediadores pró-inflamatórios na fase tardia da sepse.
3. Determinação mieloperoxidase em órgãos como medida de infiltração de neutrófilos. Mieloperoxidase (MPO) é uma enzima peroxidase presente em abundância na maioria dos granulócitos neutrófilos. É uma proteína lisossomal armazenado em grânulos azurófilos dos neutrófilos. MPO tem um pigmento heme, que faz com que sua cor verde nas secreções ricas em neutrófilos, como o pus e algumas formas de muco.
4. Bactérias carga em órgãos e sangue, medida como o número de unidades formadoras de colônia por mililitro.

3. Resultados representante

O procedimento CLP foi realizada inicialmente em camundongos C57BL / 6. Testamos vários parâmetros para modular a gravidade da sepse, alterando o comprimento da ligação e da espessura da agulha, conforme mostrado nas Figuras 1 e 2. Entre esses dois fatores, o comprimento da ligadura parece ser mais eficaz do que a espessura da agulha para alterar a sobrevivência por cento. Conforme mostrado na Figura 1, aumentando o comprimento da ligação por mais de um centímetro provoca um aumento da mortalidade de 100% em comparação com camundongos com uma ligadura de ≤ 1cm. Aumentando a espessura da agulha também diminuiu a sobrevivência por cento de 100% (com uma agulha 22G) para 55% (usando uma agulha 19G) com dois furos. Também testamos o efeito do CLP em camundongos C57BL / 6 e 129SvJ ratos para determinar se diferentes linhagens de camundongos mostrar susceptibilidade semelhantes ou distintas para CLP-induzida a sepse. A Figura 3 mostra que, nas mesmas condições, os ratos foram 129SvJ mais suscetíveis à infecção do que C57BL / 6, indicado por uma porcentagem de mortalidade aumentou.

Figura 1. Efeito do comprimento da ligadura do ceco na sobrevivência animal. CLP foi realizada em camundongos C57BL / 6 com dois diferentes comprimentos de ligadura cecal. Este único parâmetro afeta drasticamente a sobrevida do animal desde que todos os animais do grupo com uma área de ligação mais do que 1 cm morreu em menos de três dias quando comparados com um grupo de animais com uma área de ligadura de 1 cm aprox. (N = 8).

Figura 2. Influência da espessura da agulha sobre a sobrevivência. CLP foi realizada em camundongos C57BL / 6 com dois tamanhos diferentes da agulha, 19G e 22G. Camundongos com o ceco perfurado com uma agulha de 19G mostrou uma sobrevida de 55-60%. Em contraste, os ratos com o ceco perfurado com uma agulha de 22G mostrou 100% de sobrevivência, embora eles experimentaram sintomas típicos de inflamação durante os primeiros 3-4 dias, o que desapareceu depois de 4 dias (n = 8).

Figura 3. Comparação da susceptibilidade a sepse entre duas linhagens de camundongos diferentes. O modelo CLP foi realizada em 129SvJ e C57BL / 6, nas mesmas condições. No final do período de avaliação por cento a sobrevivência da cepa 129SvJ foi de 25% menos do que na cepa C57BL / 6, indicando uma maior susceptibilidade à inflamação induzida por infecção polimicrobiana. (N = 6).

Discussão

Aqui nós mostramos em detalhes como realizar o modelo CLP em camundongos e modular o grau de severidade.

Comparado a outros modelos animais de sepse, CLP pode ser realizado em qualquer tensão do rato de diferentes idades e sexo. É um procedimento relativamente fácil e barato cirúrgico. Neste modelo, o grau de gravidade tem um impacto direto sobre a porcentagem de sobrevivência. O comprimento da ligação, a espessura da agulha e do número de punções são parâmetros que podem ser co...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Ketamina	Ketaset	0856-2013-01
Xilazina	AnaSed	NADA # 139-236
Seringa de insulina 29G	Exel	26028
De seda de sutura, 6-0 PROLENE	Ethicon	8680G
Agulha 19G e 25G	BD	305186
Barbeador	Abastecimento geral	Abastecimento geral
Aquecimento da lâmpada infravermelha	Abastecimento geral	Abastecimento geral
Michel ferida clipes de 7 milímetros	Roboz Cirúrgica Instr	RS-9270
Máscara de ouvido loop	Fisher Scientific	19-130-4181
Tesouras de dissecação	Roboz Cirúrgica Instr	RS-6702
Betadine solução	VWR	63410-992
Pinça cirúrgica	Roboz Cirúrgica Instr	RS-5135
Compressa embebida em álcool isopropílico 70%	Fisher Scientific	22-031-350
Buprenorfina	Bedford Labs	55390-100-10
Tramadol	Sigma-Aldrich	42965