Purificación de proteínas ortogonales Facilitado por un marcador de afinidad biespecíficos pequeños

Resumen

Un novedoso y de alta eficiencia de dos pasos de cromatografía de afinidad protocolo ha sido desarrollado y es descrito en detalle. El método se basa en una etiqueta pequeña con dos purificación afinidades inherentes y es aplicable a una amplia gama de proteínas diana con diferentes propiedades.

Resumen

Debido a los altos costos asociados con la purificación de proteínas recombinantes de los protocolos deben ser racionalizadas. De alto rendimiento para los esfuerzos que hay una demanda de métodos generales que no requieren de la optimización de la proteína objetivo específico ^1. Para lograr esto, las etiquetas de purificación que genéticamente puede ser fusionado con el gen de interés se utilizan ^2. El asa de afinidad más utilizado es la etiqueta de hexa-histidina, que es adecuado para la purificación, tanto en condiciones nativas y desnaturalizantes ^3. La carga metabólica para la producción de la etiqueta es baja, pero no proporciona la especificidad de hasta ^1,2 competir cromatografía de afinidad estrategias basadas en.

En este caso, una etiqueta de depuración biespecíficos con dos diferentes sitios de unión de un ácido amino 46, dominio de la proteína pequeña se ha desarrollado. El dominio de unión a la albúmina se deriva de la proteína G estreptocócica y tiene una fuerte afinidad inherente a la albúmina sérica humana(HSA). Once superficie expuesta aminoácidos, que no participan en la albúmina de unión ^4, eran genéticamente al azar para producir una biblioteca combinatoria. La biblioteca de la proteína con la novela dispuestas al azar unión a la superficie (Figura 1) se expresó en las partículas de fago para facilitar la selección de carpetas de la tecnología de fagos. A través de varias rondas de biopanning contra un dímero Z-dominio derivado de la proteína A estafilocócica ^5, una pequeña molécula, biespecíficos con afinidad por los HSA y el nuevo objetivo se identificó ^6.

El dominio de la nueva proteína, denominada ABDz1, se evaluó como una etiqueta de purificación de una selección de proteínas diana con distinto peso molecular, solubilidad y punto isoeléctrico. Tres proteínas diana se expresaron en Escherichia Escherishia con la etiqueta novela fusionada a su extremo N-terminal y posteriormente purificado por afinidad. Purificación inicial en una columna inmovilizada con HSA o Z de dominio dio lugar a relativamente los productos puros. Dos pasos de purificación de afinidad con la etiqueta biespecíficos produjo una mejora sustancial de la pureza de la proteína. Medios cromatográficos con la Z-dominio inmovilizadas, por ejemplo MabSelect Claro, están disponibles para la purificación de anticuerpos y HSA puede ser químicamente unida a los medios de comunicación para proporcionar la segunda matriz.

Este método es especialmente ventajoso cuando hay una alta demanda en la pureza de la proteína diana recuperado. El bifunctionality de la etiqueta permite a dos pasos cromatográficos diferentes para ser utilizada en la carga metabólica en la expresión de acogida es limitada debido al pequeño tamaño de la etiqueta. Que proporciona una alternativa competitiva a los llamados de marcado combinatorio donde varias etiquetas se utilizan en combinación ^1,7.

Protocolo

1. La clonación de la fusión objetivo gene/ABDz1-tagged construir

1. Preparar los fragmentos de PCR del gen ABDz1 flanqueado por sitios de restricción adecuados para N-terminal de la ligadura de la meta de genes en el plásmido de expresión (un plásmido que contiene ABDz1 está disponible gratuitamente a través de un acuerdo de transferencia de material).
2. Cleave purificada vector de expresión y los fragmentos de PCR con enzimas de restricción elegido en un tampón de reacción adecuado. Purificar los productos antes de la ligadura.
3. Ligar la restringida ABDz1 fragmento en el vector de expresión que contiene el gen de interés y transformar el producto de la ligadura de E. coli (en el método original de la cepa RR1ΔM15 se utilizó ^8). Difundir las células transformadas en placas de agar suplementado con los antibióticos adecuados para la selección.
4. PCR pantalla de algunas colonias y la secuencia de verificar el cassette de expresión resultante de la secuenciación del ADN.
5. Preparar el plásmido de un cultivo de una noche de una secuencia de verifcolonia de IED y transformar a la cepa de expresión preferido (en el original método de E. coli Rosetta (DE3), recibiendo un pRARE plásmido para mejorar la producción de proteínas codificadas por los genes humanos, se utilizaron).

2. Expresión de la proteína

1. Inocular una colonia de bacterias individuales en 10 ml de caldo de soja tríptico suplementado con extracto de levadura 5 g / l, y los antibióticos adecuados. Se incuba a 150 rpm a 37 ° C durante la noche.
2. Inocular 1 ml de cultivo de una noche en 100 ml de medio fresco e inducir la expresión de la proteína (originalmente 1 mM de isopropil-β-D-tiogalactósido cuando un operón lac se utilizó), cuando las células alcanzan la fase de crecimiento logarítmico.
3. Se incuba a 150 rpm a 25 ° C durante la noche las células y la cosecha por centrifugación.

3. Purificación por afinidad ortogonal

1. Resuspender el precipitado en 25 ml de buffer en ejecución (25 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,05% (w / v) de Tween 20, pH 8,0) e interrumpir ªlas células e por ultrasonidos a 60% de la amplitud y 1.0/1.0 pulsos durante 3 min. Centrifugar la muestra y el filtro de la proteína diana que contiene sobrenadante (0,45 m) antes de la purificación adicional.
2. Equilibrar un 1 ml de HSA Sepharose o una columna de NHS-activa, con anterioridad, junto con HSA de acuerdo con las recomendaciones del proveedor, con 10 volúmenes de columna (CV) de funcionamiento de amortiguación a 1 ml / min en un sistema de purificación de proteínas adecuada. Cargue el lisado bacteriano a 0,5 ml / min y luego restablecer el caudal de 1 ml / min.
3. Lavar la columna con 5 CV de funcionamiento de amortiguación, seguido de 5 CV de tampón de lavado (5 mM NH ₄ Ac, pH 5,5).
4. Eluir la muestra con el tampón de elución (0,5 M HAc, pH 2,5) a 1 ml / min y recoger las fracciones, la absorción del monitor a 280 nm para seleccionar las fracciones del pico eluido para una mayor purificación.
5. Piscina de las fracciones con mayor concentración de proteínas, diluir dos veces en tampón de Claro en ejecución (fosfato 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2) yasegúrese de que el pH es de alrededor de neutral. Añadir 1 M Tris-HCl pH 8 para aumentar el pH si es necesario.
6. Cargue la muestra de 0,5 ml / min en una columna de 1 ml MabSelect HiTrap Seguro que ha sido equilibrada con 10 CV de tampón Claro funcionando a 1 ml / min. Restablecer el caudal de 1 ml / min después de la carga.
7. Lavar la columna con 5 VC de tampón de Seguro (paso 5) y eluir las proteínas con 0,2 M de HAc, pH 2,7. De las proteínas diana sensibles que el efluente puede ser neutralizado directamente sobre la colección mediante la adición de Tris-HCl.

Si los pasos de cromatografía se invierte el efluente de la columna MabSelect Claro que se puede diluir en la gestión de buffer (paso 3.1) y el pH aumentó a alrededor del 8 por adición de 1 M Tris-HCl. En general, se observan picos más estrechos cuando la matriz de Claro se emplea en la segunda etapa.

4. Evaluación de la pureza por electroforesis en gel de sodio dodecil sulfato de poliacrilamida (SDS-PAGE)

1. Cargar las fracciones purificadas en unala reducción de SDS-PAGE y, si lo desea, analizar el peso molecular del producto purificado por espectrometría de masas. Es importante para reducir completamente la muestra, ya una cisteína libre en ABDz1 puede causar la dimerización de los productos en condiciones no reductoras.

5. Los resultados representativos:

Como una prueba de principio, la purificación de afinidad ortogonal facilitado por la etiqueta ABDz1 se evaluaron durante tres proteínas diana humana que representan las diferentes clases de solubilidad, pesos moleculares y puntos isoeléctricos (Tabla 1). El gen ABDz1 fue fusionado genéticamente con los genes diana y las construcciones se expresaron en E. coli, la Figura 2 muestra un diagrama de flujo para todas las etapas del método de forma consecutiva. Después de la purificación por el protocolo ortogonales, las muestras recogidas en diferentes puntos fueron analizados por SDS-PAGE (Figura 3). Los resultados muestran claramente la utilidad de una etiqueta de doble y dos pasos de purificación muy específicos. A pesar de que la pureza es razonable achieved después de la etapa de purificación inicial como se ve desde los geles, el paso sucesivo se obtiene un producto muy puro muy adecuado para aplicaciones muy exigentes.

Figura 1. Diseño de la biblioteca combinatoria utiliza para la selección de la biespecíficos ABDz1 etiqueta.
Los 46 aminoácidos de unión a la albúmina pliegues de dominio en un conjunto estable de tres hélice y contiene un sitio de unión de la albúmina sérica humana, principalmente ubicados en la segunda hélice. Por genética aleatoria once superficie expuesta aminoácidos situada en la hélice de primera y tercera, una superficie de unión novela fue diseñado. Los once posiciones se indican en la figura y numeradas de acuerdo con Kraulis et al. ^9. Después de biopanning contra un dímero de la Z-dominio de la proteína A estafilocócica con la biblioteca combinatoria expresadas en fagos, el biespecíficos ABDz1 molécula fue identificada.

Figura 2. Un diagrama de flujo simplificado para el protocolo de purificación de afinidad ortogonal.
Un fragmento de PCR que contiene la secuencia ABDz1 se liga (N-terminal) con un gen de interés en un vector de expresión adecuado. La ligadura de producto se transforma en E. coli para la verificación de la secuencia y la preparación de plásmidos. Después de la transformación de un huésped de la expresión, un cultivo a gran escala para la expresión de la proteína recombinante se configura a partir de un cultivo de una noche inicial. Las bacterias se recogieron por centrifugación y se lisaron por sonicación para producir lisado bacteriano que contiene la proteína diana. Después de una etapa de filtración para eliminar los restos de partículas sólidas, el lisado se somete a purificación por afinidad ortogonal en un sistema de manejo de líquidos al someterse a dos pasos de la purificación en la sucesión. Picos eluidos de los pasos de purificación se muestrean y se evaluó por SDS-PAGE para evaluar la pureza y en comparación con el tque lisado antes de la purificación.

Figura 3. SDS-PAGE análisis de las proteínas objetivo expresado y purificado en la fusión con ABDz1.
Las muestras tomadas del lisado bacteriano de tres proteínas que se expresan en la fusión de ABDz1, en representación de diferentes propiedades, y la etiqueta de ABDz1 sí fueron recogidos, junto con muestras de los picos de la purificación en una columna de HSA-seguido de un MabSelect Sure-columna (A) . Carriles 1-4 representan muestras de lisados ​​antes de la purificación, carriles 5-8 de la HSA, aguas (primer paso) y carriles de 9.12 de la purificación MabSelect Claro (segunda etapa). Las muestras se cargan en el siguiente orden: ABDz1-141377, ABDz1-HT875, ABDz1-HT2375 y ABDz1. Además, las muestras adquiridas a partir de los lisados ​​mismo purificado en el orden inverso en las mismas columnas se analizaron (B). Carriles 1-3 representan muestras de lisados ​​antes de la purificación, carriles de 4.6 from MabSelect Claro, aguas (primer paso) y los carriles 7-9 de HSA, aguas (segundo paso). Las muestras se cargaron en el mismo orden que en (A) pero la etiqueta no está incluido. A partir de esos resultados está claro que este método de dos pasos produce proteínas altamente purificadas, independientemente del orden en que las medidas se aplican.

Nombre b	Proteína diana Uniprot c	Molecular peso (kDa)	Solubilidad clase d	Peso molecular del producto de la fusión (kDa)	Punto isoeléctrico del producto de la fusión
141377	B7Z315	17.4	4	23.7	8.5
HT875	P01040	10.8	3	17.1	4.9
HT2375	P00740	8.9	5	15.2	6.8

1. Peso molecular de ABDz1 etiqueta sólo es de 6,3 kDa, punto isoeléctrico 6,7.
2. Proteína diana representa una parte de la proteína Uniprot.
3. http://www.uniprot.org .
4. Solubilidad clase de fragmento de la proteína N-terminal con sus ₆ ABP ^10.

Tabla 1. Proteínas de la meta y los productos de la fusión con ^una etiqueta ABDz1 evaluado en un estudio de prueba de principio.

Tres proteínas únicas humanos con distinto peso molecular, solubilidad y punto isoeléctrico fueron elegidos para la expresión y la purificación por el enfoque de afinidad ortogonal.

Discusión

El protocolo de purificación de afinidad ortogonal que aquí se presenta permite la purificación eficiente de una amplia gama de proteínas diana. Mediante la combinación de los inherentes al sitio de unión del dominio de unión a la albúmina, con una superficie de unión novela, una etiqueta pequeña proteína biespecíficos se desarrolló. Es muy sencillo de utilizar la etiqueta ya que simplemente puede ser clonado y expresado en la fusión a cualquier proteína de interés en un vector de expresión preferido. Equipamiento de serie disponible en la mayoría de los laboratorios pueden emplearse para la purificación de proteínas de dos pasos. Dado que la función de la etiqueta ABDz1 depende de plegamiento correcto del dominio para exponer de manera eficiente sus dos superficies de unión, el método se limita a las proteínas expresadas en forma soluble y no es adecuado para las purificaciones en condiciones desnaturalizantes. Los agentes reductores deben también ser evitados, ya que interfiere con la unión de ABDz1 a la Z-dominio en la matriz MabSelect Claro.

Ortogonales purificación de afinidadción ofrece una alternativa útil a los métodos tradicionales con el fin de satisfacer las necesidades de proteínas de alta pureza en muchas aplicaciones exigentes. Al mismo tiempo, este método elimina la necesidad de etiquetar combinatoria cuando las diferentes estrategias de depuración se utilizan en la sucesión. Para aplicaciones que requieren una proteína diana nativo, un sitio de escisión de la proteasa pueden ser introducidos para hacer la eliminación enzimática de la etiqueta ABDz1 posible ^11. Además, la etiqueta ABDz1 es el primer dominio biespecíficos pequeña proteína plegada y descritas hasta la fecha. Es único, ya que proporciona una estrategia de depuración que depende de dos interacciones de afinidad específicos. En el futuro sería interesante ampliar este concepto mediante el desarrollo de nuevas etiquetas biespecíficos que llevan a nuevas superficies de unión que son compatibles con las resinas de cromatografía fácilmente disponibles y baratos. Por ejemplo, mediante la sustitución de los aminoácidos involucrados en la unión a la albúmina con residuos básicos, una etiqueta compatible con ien la cromatografía de intercambio puede ser alcanzable. Un concepto similar se ha demostrado su eficacia por la ingeniería encargada de la Z-dominio para generar etiquetas conocido como Z ¹² y Z _{ácido básico} ¹³ compatible con el intercambio de aniones y cationes, respectivamente.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
E. coli RR1ΔM15	American Type Culture Collection	35102
E. coli Rosetta (DE3)	Novagen	70954
Caldo de soja tríptico	Difco	211822
Extracto de levadura	Difco	212720
Vibra sonicador celular	Sonics y los materiales	-
HSA Sepharose	Pharmacia Biotech	Producto anterior
HiTrap Claro MabSelect	GE Healthcare	11-0034-93
HiTrap NHS-activado HP columna	GE Healthcare	17-0716-01