Küçük Bispecific Affinity Tag Kolaylaştırılmış Ortogonal Protein Saflaştırma

Özet

Yeni ve son derece verimli, iki kademeli afinite kromatografisi protokolü geliştirildi ve ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu yöntem iki içsel yakınlık küçük bir arıtma etiketi dayanan ve farklı özelliklere sahip geniş bir hedef proteinlerin uygulanabilir.

Özet

Protokolleri rasyonalize gerekir rekombinant proteinlerin saflaştırılması ile ilgili yüksek maliyetler nedeniyle. Yüksek verimli çalışmalar için hedef protein özel optimizasyon ¹ gerekmez genel yöntemler için bir talep vardır. Bunu başarmak için, genetik ilgi gen erimiş olabilir arıtma etiketleri genellikle ² kullanılır. En yaygın olarak kullanılan bir yakınlık kolu hexa-histidin etiketi, yerli ve denatüre edici ^koşullar 3 hem de altında arıtma için uygundur . Etiketiyle üretimi için metabolik yükünün düşük, ama rakip afinite kromatografisi dayalı stratejiler ^1,2 gibi yüksek bir özgüllük olarak sağlamaz .

Burada, 46 amino asit iki farklı bağlanma yerleri ile bispecific arıtma etiketi, küçük protein etki alanı olmuştur. Albümin bağlayıcı etki alanı Streptokoksik protein G türetilmiştir ve insan serum albümin güçlü bir doğal yakınlığına sahiptir.Kalkış Desteği (HSA). Onbir yüzey maruz albümin bağlayıcı ⁴ ilgisi olmayan amino asitler, kombinatoryal bir kütüphane üretmek için genetik olarak randomize edildi . Rastgele bağlayıcı yüzey (Şekil 1) düzenlenen romanı ile protein kütüphane faj ekran teknolojisi bağlayıcı seçimi kolaylaştırmak için faj partikülleri ifade edildi. Dimerik karşı biopanning birkaç tur sayesinde Z Stafilokokal protein A ^5, HSA ve roman hedef ⁶ tespit edildi hem yakınlığa sahip küçük bir bispecific molekül türetilmiş etki alanı.

ABDz1 olarak anılacaktır roman protein etki, farklı molekül ağırlığı, çözünürlük ve izoelektrik nokta ile hedef proteinlerin bir seçim için bir arınma etiketi olarak değerlendirildi. Üç hedef proteinlere Escherishia coli K-Termini erimiş ve daha sonra afinite saflaştırılmış roman etiketiyle ifade edildi. Immobilize HSA veya Z-etki alanı ya da bir sütun ilk arıtma ilişkiler sonuçlandıvely saf ürünler. Bispecific etiketi ile iki adım yakınlık arıtma protein saflık önemli bir iyileşme sonuçlandı. Kromatografik Z-alanıyla medya, Sure örnek MabSelect, immobilize antikor saflaştırılması için hazır ve HSA kolayca kimyasal ikinci matris sağlamak için medya birleştiğinde olabilir.

Kurtarılan hedef proteinin saflığı yüksek bir talep olduğunda bu yöntem özellikle avantajlıdır. Ifade ev sahibi metabolik yük etiketiyle küçük boyutu nedeniyle sınırlı iken etiketi bifunctionality iki farklı kromatografik adımları kullanılmasına izin verir. Birden fazla etiket kombinasyonu ^1,7 kullanılır Kombinatoryal etiketleme denilen rekabetçi bir alternatif sunuyor.

Protokol

1. Klonlama inşa hedef gene/ABDz1-tagged füzyon

1. Ifade plazmid hedef gen (plazmid içeren ABDz1 bir malzeme transferi anlaşması üzerinden serbestçe kullanılabilir) N-terminal ligasyonu için uygun kısıtlama siteleri tarafından çevrili ABDz1 geninin PCR parçaları hazırlayın.
2. Cleave saflaştırılmış ifade vektör ve uygun bir reaksiyon tamponu seçilen restriksiyon enzimleri ile PCR parçaları. Ligasyonu önce ürünleri arındırın.
3. , Ilgi gen içeren ekspresyon vektörü sınırlı ABDz1 parçası bağlanır ve E. ligasyonu ürün dönüşümü coli (orijinal yöntem RR1ΔM15 zorlanma ⁸ kullanılmıştır). Seçim için uygun antibiyotikler ile takviye agar plaklarına dönüştürülmüş hücreleri yayılmıştır.
4. PCR ekran birkaç koloni ve sıra DNA dizi analizi ile ortaya çıkan ifade kaset doğrulayın.
5. Bir gecede bir dizi verif kültürü plazmid hazırlayınIED koloni ve tercih edilen bir ifade suşu (Rosetta insan genleri tarafından kodlanan proteinlerin üretimini artırmak için plazmid bir pRARE barındıran özgün yöntemi E. coli (de3) kullanılmıştır) dönüşüm .

2. Protein ekspresyonu

1. Tek bir bakteri kolonisi, 5 g / l maya özü ve uygun antibiyotik ile desteklenmiş triptik soy broth 10 ml inoküle edin. ° C gecede 37 150 rpm'de inkübe edin.
2. 1 ml, 100 ml taze orta gecede kültür aşılamak ve hücrelerin logaritmik büyüme fazı ulaştığınızda protein ekspresyonu (lac operonunun kullanılan izopropil-β-D-thiogalactoside başlangıçta 1 mM) neden.
3. 150 rpm'de 25 ° C gecelik ve hasat hücreler santrifüj tarafından inkübe edin.

3. Ortogonal yakınlık arıtma

1. 25 ml çalıştıran tamponu (25 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA,% 0.05 (w / v) Tween 20, pH 8.0) pelletini tekrar ve th bozabilir% 60 genlik ve 3 dakika 1.0/1.0 bakliyat sonication e hücreleri. Örnek Santrifüj ve supernatant (0,45 mikron) ve daha ileri saflaştırma önce hedef protein içeren filtre.
2. 1 ml / dak 'da uygun bir protein arıtma sistemi tampon çalışan 10 sütun hacimleri (CV) ile tedarikçi tavsiyelerine göre daha önce HSA ile birleştiğinde ya da 1 ml HSA sepharose kolon veya NHS aktif sütun, muvazene. 0.5 ml / dak bakteriyel lizat yükleyin ve sonra akış hızı 1 ml / dak sıfırlanır.
3. 5 yıkama tampon CV (5 mM NH ₄ Ac, pH 5.5) takip çalışan tampon CV ile 5 sütun yıkayın.
4. 1 ml / dak elüsyon tamponunda (0.5 M HAC, pH 2.5) ile örnek Zehir ve daha ileri saflaştırma için yıkandı, zirveden kesirler seçmek için 280 nm, monitör emme kesirleri toplamak.
5. Yüksek protein konsantrasyonu Havuz kesirler, Sure çalışan tampon iki kez seyreltilmiş (20 mM fosfat, 150 mM NaCl, pH 7.2) vepH yaklaşık nötr olduğundan emin olun. Gerekirse pH artırmak için 1 M Tris-HCl, pH 8 ekleyin.
6. 0.5 ml / dk, 1 ml / dak Sure çalışan bir tampon 10 CV ile dengelenmiş bir 1 ml HiTrap MabSelect Sure sütun örnek yükleyin. Yükledikten sonra 1 ml / dak akış hızı sıfırlayın.
7. Tabii çalışan tampon 5 CV (adım 5) sütun yıkayın ve 0.2 M HAC, pH 2.7 ile proteinlerin Zehir. Hassas hedef proteinlerin eluat toplama üzerine Tris-HCl ilavesi ile doğrudan nötralize edilebilir.

Kromatografik adımlar MabSelect eluat tersine çevrilirse Sure sütun tampon (adım 3.1) çalışan seyreltilir ve 1 M Tris-HCl ilave edilerek pH yaklaşık 8 artış olabilir. Emin matris ikinci adımı istihdam Genel olarak, dar doruklarına görülmektedir.

4. Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile saflık Değerlendirme

1. Yük bir saflaştırılmış fraksiyonlarıeğer istenirse, kütle spektrometresi ile analiz arındırılmış ürün molekül ağırlığı, SDS-PAGE azaltılması ve. ABDz1 ücretsiz bir sistein düşürücü olmayan koşullar altında ürün dimerization neden olabilir bu yana tam örnek azaltmak için önemlidir.

5. Temsilcisi Sonuçlar:

Ilkesinin bir kanıtı olarak, dik yakınlık arıtma ABDz1 etiketi ile kolaylaştırdı farklı çözünürlük sınıfları, moleküler ağırlık ve izoelektrik noktaları (Tablo 1) temsil eden üç insan hedef proteinlerin değerlendirildi. ABDz1 gen, genetik, hedef genlerin erimiş ve yapıları E. coli ifade edildi, Şekil 2 ardışık yöntemi tüm adımlar için bir akış şeması gösterir. Dik protokolü tarafından arıtma ardından, farklı noktalarda toplanan numuneler, SDS-PAGE (Şekil 3) ile analiz edildi. Sonuçları bir çift etiket ve iki son derece özel bir arıtma adımları yararını açıkça göstermektedir. Makul bir saflık ac olsa bilehieved jeller görüldüğü gibi ilk arıtma adımdan sonra, ardışık adım de son derece zorlu uygulamalar için uygun, çok saf bir ürün elde edilir.

Şekil 1 bispecific ABDz1 etiketi seçimi için kullanılan Kombinatoryal kütüphane tasarımı.
46 amino asit albümin bağlayıcı etki alanı istikrarlı bir üç sarmal paket içine kıvrım ve özellikle ikinci sarmal bulunan insan serum albümin için bağlayıcı bir site içerir. Genetik on birinci ve üçüncü sarmal bulunan yüzey maruz kalan amino asitler rastgele olarak, yeni bir bağlayıcı yüzey mühendisliği oldu. Onbir pozisyonları rakam gösterilir ve Kraulis ve ark göre numaralandırılmıştır. ^[9 ]. Faj üzerinde ifade Kombinatoryal kütüphanesi ile, bispecific ABDz1 molekül tespit edildi Stafilokokal protein Z etki alanı bir dimer karşı biopanning ardından.

Şekil 2. dik benzeşme arıtma protokolü için basitleştirilmiş akış şeması.
ABDz1 dizisi içeren bir PCR-parçası, uygun bir ifade vektör ilgi bir gen ile (N-terminal) bağlandı. Ligasyonu ürün E. dönüştürülmüştür. sıra doğrulama ve plazmid hazırlık için coli. Bir ifadesi ev sahibi dönüşümün ardından, rekombinant protein ekspresyonu için büyük ölçekli bir kültür, bir ilk gecede kültür kurulur. Bakteriler santrifüj yoluyla, hedef protein içeren bakteriyel lizat üretmek için hasat ve sonication tarafından parçalanmış. Artık katı parçacıklar kaldırmak için bir filtrasyon adımdan sonra art arda iki arıtma adımları geçiren lizat bir sıvı taşıma sistemi dik yakınlık arıtma tabi tutulur. Yıkandı, hem de arıtma adımları doruklarına örneklenmiş ve saflık değerlendirmek için SDS-PAGE tarafından değerlendirilir ve t karşılaştırıldığındao arıtma önce lizat.

Şekil 3. füzyon ifade ABDz1 ile saflaştırılmış hedef proteinleri SDS-PAGE analizi.
Sure-sütun MabSelect tarafından izlenen bir HSA-sütun üzerinde arıtma karşılık gelen doruklarına örnekler, farklı özellikler gösteren ABDz1, ABDz1 Etiketin kendisi için füzyon ifade üç proteinlerin bakteriyel lizat alınan numuneler ile bir araya toplanmıştır (A) . Lanes 1-4 9-12 MabSelect Sure arıtma (ikinci adım) arıtma, HSA arıtma şerit 5-8 (ilk adım) ve şerit önce lizatları örnekler temsil eder. ABDz1-141.377, ABDz1-HT875, ABDz1-HT2375 ve ABDz1: Örnekler aşağıdaki sırayla yüklenir. (B) yanı sıra, aynı sütun üzerinde tersten saflaştırılmış aynı lizatları elde örnekleri incelendi. Lanes arıtma, şerit 4-6 f önce lizatları örnekleri temsil 1-3rom MabSelect emin arıtma (ilk adım) ve HSA arıtma (ikinci adım) şerit 7-9. Örnekleri (A), ancak etiket kendisi dahil değildir olarak aynı sırayla yüklendi. Bu sonuçlardan yola çıkarak bu iki adımlı bir yöntem adımları sırayla uygulanır bakılmaksızın yüksek derecede saflaştırılmış protein verir açıktır.

Adı b	Hedef protein Uniprot c	Moleküler ağırlık (kDa)	Çözünürlük sınıf d	Molekül ağırlığı füzyon ürünü (kDa)	Izoelektrik nokta füzyon ürün
141377	B7Z315	17,4	4	23,7	8,5
HT875	P01040	10,8	3	17,1	4,9
HT2375	P00740	8,9	5	15,2	6,8

1. Yalnız ABDz1 etiketi Molekül ağırlığı 6.3 kDa, izoelektrik noktası 6.7.
2. Hedef protein, Uniprot protein bir kısmını temsil eder.
3. http://www.uniprot.org .
4. N-terminal protein parçası Onun ₆ ABP ¹⁰ Çözünürlüğü sınıfı.

Tablo 1. ABDz1 etiketi ile hedef proteinler ve füzyon ürünleri ^bir ilke çalışmanın bir kanıtı olarak değerlendirilir.

Üç farklı molekül ağırlığı, çözünürlük ve izoelektrik noktası eşsiz insan proteinleri dik benzeşme yaklaşımı ile ifade ve saflaştırılması için seçilmiştir.

Tartışmalar

Burada sunulan dik benzeşme arıtma protokolü hedef proteinlerin geniş bir yelpazede etkili arınma sağlar. Bağlayıcı bir roman yüzeyi ile albümin bağlayıcı etki doğasında bağlayıcı site birleştirerek, küçük bir bispecific protein etiketi geliştirilmiştir. Bu, sadece herhangi bir tercih ifade vektör ilgi herhangi bir protein klonlanmış ve füzyon ifade beri etiket kullanmak için çok basittir. Çoğu laboratuvarlarda kullanılabilir Standart donanım, iki adımlı bir protein saflaştırılması için istihdam edilebilir. ABDz1 etiketi etki alanı verimli bir şekilde iki bağlayıcı yüzeyler ortaya çıkarmak için doğru katlama fonksiyonu bağlı olduğundan, bu yöntem çözünür şeklinde ifade proteinler sınırlı ve denatüre koşulları altında saflaştırılması için uygun değildir. Indirgeyici ajanlar, MabSelect emin bir matris üzerine Z-etki alanına ABDz1 bağlama ile müdahale yılından bu yana da kaçınılmalıdır.

Ortogonal afinite purificaTION birçok zorlu uygulamalar proteinlerin yüksek oranda saflaştırılmış gereksinimlerini karşılamak için geleneksel yöntemlere bir alternatif sağlar. Bu yöntem aynı zamanda, farklı saflaştırma stratejileri arkaya kullanılan Kombinatoryal etiketleme ihtiyacını ortadan kaldırır. Yerli bir hedef protein gerektiren uygulamalar için, mümkün ABDz1 etiketi ¹¹ enzimatik kaldırılmasını işlemek için proteaz bölünme sitesi tanıtıldı olabilir. Ayrıca, bugüne kadar açıklanan ilk bispecific küçük ve katlanmış protein etki alanı ABDz1 etiketi. Iki hedef özel yakınlık etkileşimleri bağlıdır arıtma stratejisi sağlar çünkü benzersizdir. Geleceğe hazır ve ucuz kromatografik reçine ile uyumlu olan yeni bağlayıcı yüzeyler taşıyan roman bispecific etiketleri gelişmekte olan bu konsepti genişletmek için ilginç olacaktır. Örneğin, temel kalıntıları, bir etiketi i ile uyumlu amino asitler albümin bağlayıcı bir yer değiştirerekdeğiştirici kromatografi ulaşılabilir olabilir. Benzer bir kavram, sırasıyla, _Z ^{asit 12} ve _Z ^temel 13 anyon ve katyon değişim ile uyumlu olarak bilinen etiketleri oluşturmak için Z-etki sorumlu mühendislik etkili olduğu kanıtlanmıştır .

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifi Adı	Şirket	Katalog numarası
E. coli RR1ΔM15	Amerikan Tip Kültür Koleksiyonu	35102
Rosetta E. coli (de3)	Novagen	70954
Triptik soy broth	Difco	211822
Maya özü	Difco	212720
Titreşim hücre sonikatör	Sonics ve malzeme	-
HSA sepharose	Pharmacia Biotech	Eski ürün
Tabii HiTrap MabSelect	GE Healthcare	11-0034-93
HiTrap NHS aktive HP sütun	GE Healthcare	17-0716-01