小型二重特異性アフィニティタグによって容易に直交するタンパク質の精製

要約

小説や高効率二段アフィニティークロマトグラフィーのプロトコルが開発され、詳細に説明されている。方法は2つの固有の親和性を持つ小型の精製タグに基づいており、異なるプロパティを持つ標的タンパク質の広い範囲に適用可能です。

要約

プロトコルは、合理化する必要がある組換えタンパク質の精製に伴う高コストのために。ハイスループットな努力のために、標的タンパク質の特定の最適化^1を必要としない一般的な方法が求められている。これを達成するために、遺伝的に関心の遺伝子に融合させることができる精製タグは、一般的に^2を使用されています。最も広く使用されている親和性のハンドルは、ネイティブと変性条件^3の両方での精製に適しているヘキサ-ヒスチジンタグ、です。タグを生成するための代謝負担は低いですが、競合するアフィニティークロマトグラフィーベースの戦略の^1,2のような高特異性としては提供されません。

ここでは、46アミノ酸の異なる2つの結合部位を有する二重特異精製タグは、小さなタンパク質ドメインが開発されている。アルブミン結合ドメインは、連鎖球菌プロテインGに由来し、ヒト血清アルブミンへの強力な固有の親和性を有している（HSA）。アルブミン結合⁴に関与していない十一面に露出したアミノ酸は、コンビナトリアルライブラリーを生成するために遺伝的に無作為に割り付けられた。小説で蛋白質のライブラリをランダムに配置された結合面（図1）は、ファージディスプレイ技術によるバインダーの選択を容易にするために、ファージ粒子上に発現していた。ブドウ球菌性タンパク質⁵から派生した二量体のZ -ドメインに対するバイオパニングのいくつかのラウンドを通じ、HSAおよび新規ターゲットの両方に対して親和性を有する小、二重特異性分子は^、6を同定された。

ABDz1と呼ばれる新規な蛋白質ドメインは、異なる分子量、溶解性及び等電点を持つ標的タンパク質の選択のための精製タグとして評価した。 3つのターゲットタンパク質は、それらのN -末端およびその後アフィニティー精製に融合させた斬新なタグでEscherishia大腸菌で発現させた。固定化HSAまたはZ -ドメインのいずれかで列で初期精製はrelatiをもたらしたvely純粋な製品。二重特異性タグと二段階のアフィニティー精製は、タンパク質の純度の大幅な改善が得られた。固定化Z -ドメインとのクロマトグラフ媒体は、確かに例のMabSelectのために、容易に化学的に第二のマトリックスを提供するためにメディアに結合することができる抗体とHSAの精製のために容易に入手可能である。

回収された標的タンパク質の純度の高需要がある場合は、この方法が特に有利である。発現宿主の代謝負担がタグの小さなサイズのために制限されている間にタグの二機能性は、2つの異なるクロマトグラフィー工程を使用することができます。それは複数のタグを組み合わせて^1,7で使用されている、いわゆるコンビナトリアルタギングに競争力のある代替手段を提供します。

プロトコル

1。ターゲットのクローニングは、融合構築物をgene/ABDz1-tagged

1. 発現プラスミドに目的遺伝子（プラスミド含むABDz1は材料移転契約を通じて自由に利用可能である）のN末端ライゲーションのための適当な制限部位に隣接ABDz1遺伝子のPCR断片を準備する。
2. 適切な反応バッファーで選択した制限酵素による開裂精製発現ベクターとPCR断片。ライゲーションの前に製品を精製する。
3. 目的の遺伝子を含む発現ベクターに制限されたABDz1断片をライゲーションし、E.にライゲーション産物を変換大腸菌 （元のメソッドでRR1ΔM15ひずみが^8を使用^していた）。選択のための適切な抗生物質を補充した寒天プレート上で形質転換細胞を広げる。
4. PCR画面少数のコロニーとシーケンスは、DNAシーケンシングにより得られた発現カセットを確認してください。
5. シーケンスverifの一晩培養液からプラスミド準備IEDコロニーと好ましい発現株（ヒト遺伝子がコードするタンパク質の産生を向上させるためにプラスミドpRAREをホスティングしているロゼッタ元のメソッド大腸菌 （DE3）、で、使用された）に変換。

2。タンパク質発現

1. 5g / lの酵母エキスと適切な抗生物質を補充したトリプシン大豆ブロス10mlに単一の細菌コロニーを接種。 37℃で一晩150rpmでインキュベートする。
2. 100ミリリットルの新鮮な培地で一晩培養液1mlを接種し、細胞が対数増殖期に達するとタンパク質発現（lacオペロンを利用したイソプロピル-β- D -チオガラクトシド本来の1mM）を誘導する。
3. 遠心分離で25℃一晩と収穫細胞で150rpmでインキュベートする。

3。直交アフィニティー精製

1. 25ミリリットルランニングバッファー（25mMのトリス- HCl、200 mMのNaCl、1mMのEDTA、0.05％（w / v）のTween 20を、pH8.0）にペレットを再懸濁し、目を混乱させる60％の振幅と3分間1.0/1.0パルスで超音波処理によってEが細胞。サンプルを遠心し、さらに精製する前に、上清を（0.45μM）を含む標的タンパク質をフィルタリング。
2. 適切なタンパク質精製システムで、1ml /分でバッファを実行しているの10カラム体積（CV）を使用して、以前に販売業者の勧告によるとHSAとの結合のどちらか1ミリリットルHSAセファロースカラムまたはNHS -活性化カラムを、平衡化させます。 0.5ml /分で細菌のライセートをロードして、流速は1ml /分にリセットされます。
3. 洗浄バッファーの5 CV（5 mMのNH ₄ AC、pH5.5）に続いて実行されているバッファの5 CVでカラムを洗浄。
4. 1ml /分で溶出バッファー（0.5 M HAC、pHは2.5）でサンプルを溶出し、さらに精製するための溶出ピークからの画分を選択するには280nmで、モニターの吸収を画分を集めた。
5. プール最高タンパク質濃度と分画は、確かにランニングバッファー（20mMリン酸、150mMのNaCl、pH7.2）中で2回希釈し、pHが中性付近であることを確認してください。 pHは必要に応じて増加させる1 Mトリス塩酸pHが8を追加します。
6. 1ml /分で確かにランニングバッファーの10 CVで平衡化した1mlのハイトラップのMabSelect確かカラムに0.5ml /分でサンプルをロードします。ローディング後1 ml / minの流量をリセットします。
7. 確かにランニングバッファーの5 CV（ステップ5）でカラムを洗浄し、0.2 M HAC、pHは2.7でタンパク質を溶出させる。敏感な標的タンパク質の場合は溶出液は、トリス- HClの添加によっては採取後、直接中和することができる。

クロマトグラフィー工程はMabSelectの溶出液を逆にしている場合は確かにカラムを緩衝液（ステップ3.1）実行中に希釈し、pHは1 Mトリス- HClを加えて約8に増加することができます。確かに行列は第二段階で採用されている場合、一般的に、狭いピークが観察される。

4。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS - PAGE）により純度の評価

1. で精製した画分をロードするSDS - PAGEを削減し、必要に応じて、質量分析法により精製物の分子量を分析する。 ABDz1の遊離システインは、非還元条件下での製品の二量体化を引き起こす可能性があるので、それはサンプルを完全に削減することが重要です。

5。代表的な結果：

原理の証明として、ABDz1タグによって促進された直交アフィニティー精製は、異なる溶解性クラス、分子量および等電点（表1）を表す3つのヒト標的タンパク質を評価した。 ABDz1遺伝子が遺伝的に標的遺伝子に融合され、構造が大腸菌で発現され、図2は、連続してメソッド内のすべてのステップのためのフローチャートを示しています。直交プロトコルによる精製の後、異なる時点で採取した試料は、SDS - PAGE（図3）により分析した。結果は明らかに二重のタグが二高度に特異的な精製段階の有用性を示す。合理的な純度はACであるにもかかわらず、としてゲルから見た初期精製ステップの後にhieved、連続的なステップはよく非常に要求の厳しいアプリケーションに最適な非常に純粋な生成物が得られる。

図1二重特異性ABDz1タグの選択に使用するコンビナトリアルライブラリーのデザイン。
46アミノ酸アルブミン結合ドメインの安定threeヘリックス束に折り目と、それは主に第2ヘリックスに位置するヒト血清アルブミンに対する結合部位が含まれています。遺伝的にファーストとサードヘリックスに位置eleven表面露出アミノ酸をランダム化することにより、新規の結合面が設計されました。 elevenの位置は図に示され、Kraulisらによれば、番号が付けられています^。9。ファージ上に発現するコンビナトリアルライブラリとブドウ球菌蛋白質のZ -ドメインの二量体に対するバイオパニングに続いて、二重特異性ABDz1分子が同定された。

図2。直交アフィニティー精製プロトコールの簡易フローチャート。
ABDz1配列を含むPCRフラグメントを適当な発現ベクターに目的の遺伝子で（N末端）連結されている。ライゲーション産物を大腸菌に形質転換されるシーケンスの検証とプラスミド調製用の大腸菌 。発現宿主に形質転換後、組換えタンパク質発現のための大量培養は、最初の一晩培養から設定されています。細菌を遠心分離により回収し、標的タンパク質を含む細菌溶解物を生成するために超音波処理によって溶解されています。残留固体粒子を除去する濾過工程の後、ライセートは、連続する二つの精製工程を経ることにより、液体ハンドリングシステム上で直交するアフィニティー精製に供される。両方の精製工程からの溶出ピークをサンプリングし、評価をSDS - PAGEにより純度を評価するとtを比較し彼は、精製前にライセート。

ABDz1と融合して発現し、精製した標的タンパク質の図3。SDS - PAGE分析。
異なる特性を表すABDz1、、とABDz1タグ自体に融合で表現三つのタンパク質の細菌溶解物から採取したサンプルは、確実なカラムMabSelect続いてHSA -カラム上で精製から対応するピークからのサンプルと一緒に採取された（） 。レーン1-4 9-12 MabSelect確かに精製（第二段階）から精製、HSA -精製からレーン5-8（第一段階）と車線の前に溶解液からサンプルを表します。 ABDz1 - 141377、ABDz1 - HT875、ABDz1 - HT2375とABDz1：サンプルは次の順序で読み込まれます。さらに、同じ列に逆の順序で精製した同じ溶解物から取得したサンプルを分析した（B）。 1から3レーンは、精製前にライセートからレーン4-6 fをサンプルを表してHSA -精製（第二段階）からROM MabSelect確実な精製（第一段階）とレーン7-9サンプルは、（A）が、タグ自体が含まれていないのと同じ順序でロードされた。これらの結果から、この二段階方式に関係なく手順が適用される順序の高度に精製したタンパク質をもたらすことは明らかである。

名前B	標的タンパク質 UNIPROT C	分子 重量（分子量）	溶解度 クラスD	分子 融合産物（分子量）の	等電点 融合産物の
141377	B7Z315	17.4	4	23.7	8.5
HT875	P01040	10.8	3	17.1	4.9
HT2375	P00740	8.9	5	15.2	6.8

1. 単独でABDz1タグの分子量は6.3 kDaの、等電点6.7です。
2. 標的タンパク質は、UniProtのタンパク質の一部を表します。
3. http://www.uniprot.org 。
4. N -末端His ₆ ABP ¹⁰のタンパク質断片の溶解度クラス。

表1。 ABDz1タグと標的タンパク質との融合製品は、原理の研究の証拠で評価。

異なる分子量、溶解性及び等電点を持つ3つのユニークな人間のタンパク質は、直交する親和性のアプローチによって発現および精製のために選ばれた。

ディスカッション

ここで紹介する直交アフィニティー精製プロトコールは、標的タンパク質の広い範囲の効率的な精製が可能になります。新規の結合面とアルブミン結合ドメインの固有の結合部位を組み合わせることで、小さな二重特異性タンパク質のタグが開発されました。それは単に好みの発現ベクターへの関心の任意のタンパク質にクローニングし、融合で表現できるので、タグを利用することは非常に簡単です。ほとんどの研究室で利用できる標準的な装置は、2段階のタンパク質精製に用いることができる。 ABDz1タグの機能を効率的にその二つの結合面を公開するドメインの正しいフォールディングに依存しているので、方法は、可溶性形態で発現されるタンパク質に制限され、変性条件下で精製には適していません。彼らはMabSelect確かマトリックス上にZ -ドメインへABDz1の結合を妨害するので、還元剤も避けるべきである。

直交親和性精製用るには、非常に多くの要求の厳しいアプリケーションでのタンパク質の精製の要件を満たすために、従来の方法に有用な代替手段を提供します。同時に、この方法は、別の精製戦略を連続して使用されているコンビナトリアルタグ付けする必要がなくなります。ネイティブターゲットのタンパク質を必要とするアプリケーションには、プロテアーゼの切断部位は、可能な限りABDz1タグ¹¹の酵素的除去をレンダリングするために導入される可能性があります。さらに、ABDz1タグは、日付に説明した最初の二重特異性小と折り畳まれたタンパク質のドメインです。は、2つのターゲット特異的親和性の相互作用に依存する精製戦略を提供するので、それはユニークです。将来的には、容易に入手可能で安価なクロマトグラフィー樹脂と互換性のある新たな結合面を運ぶ新たな二重特異性タグを開発することにより、この概念を拡張するために興味深いものになるだろう。例えば、塩基性残基とアルブミン結合に関与するアミノ酸を置き換えることにより、私との互換性タグ交換クロマトグラフィーで得られる場合があります。同様の概念はそれぞれ、Z _酸 ¹²と陰イオンと陽イオン交換と互換性のあるZ _基本的な ¹³として知られているタグを生成するためにZ -ドメインの電荷のエンジニアリングによって効果が証明されています。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号
大腸菌 RR1ΔM15	アメリカンタイプカルチャーコレクション	35102
ロゼッタ大腸菌 （DE3）	Novagen社	70954
トリプシン大豆ブイヨン	ディフコ	211822
酵母の抽出	ディフコ	212720
振動の細胞の音波処理	ソニックスと材料	-
HSAセファロース	ファルマシアバイオテク	旧製品
確かにハイトラップMabSelect	GEヘルスケア	11-0034-93
ハイトラップNHS -活性化HPカラム	GEヘルスケア	17-0716-01