由一个小型的双特异性亲和标签的推动正交蛋白质纯化

摘要

已开发一种新的和高效两步亲和层析协议，并进行了详细描述。该方法是基于一个小净化标签有两个固有的亲和力，适用于广泛的目标蛋白质具有不同的属性。

摘要

由于相关的协议需要合理化的重组蛋白的纯化成本高。对于高吞吐量的努力，是一个一般的方法不需要目标蛋白质^的特定优化1的需求。要做到这一点，纯化，基因可以融合到感兴趣的基因标签是常用的^2。使用最广泛的亲和力处理的六溴氨酸标签，这是进行净化，适合在本地和^变性条件3。生产标签的代谢负担低，但它不提供高特异性的亲^和层析1,2为基础的战略。

在这里，有两种不同的结合位点上的46个氨基酸的双特异性纯化标签，小的蛋白质结构域已被开发。白蛋白结合域是来自链球菌G蛋白，人血清白蛋白具有很强的固有的亲和力（HAS）。 11个表面暴露的氨基酸，不涉及^白蛋白结合4，基因随机产生一个组合库。有人对噬菌体颗粒随机安排结合表面（图1）小说中的蛋白质库噬菌体展示技术，以方便选择粘合剂。经过几轮针对二聚体biopanning z域从金黄色葡萄球菌蛋白A ^5，小双功能分子，具有亲和力HSA和新颖的目标是确定的⁶派生。

新的蛋白质结构域，简称为ABDz1，被评为为选择目标蛋白质具有不同的分子量，溶解度，等电点的纯化标签。三个目标蛋白的N -末端融合，此后亲和纯化的小说标签表示在Escherishia大肠杆菌 。初步净化与固定的HSA或z域的列导致relatively纯的产品。两步双特异标记的亲和纯化，蛋白纯度大幅改善。色谱媒体与Z域的固定化，例如MabSelect当然，是现成的抗体纯化和HSA的化学可以很容易地被加上媒体提供的第二个矩阵。

这种方法尤其有利时，有一个恢复的目标蛋白的纯度高的需求。要使用两种不同的层析步骤bifunctionality标签允许表达宿主的代谢负担是有限的，由于体积小标签。所谓组合标记多个标签^1,7组合使用，它提供了一个竞争力的替代。

研究方案

1。 gene/ABDz1-tagged目标融合克隆构建

1. 准备合适的酶切位点，在靶基因的表达质粒（质粒含有ABDz1是免费的，通过材料转让协定）的N -末端结扎两侧ABDz1基因的PCR片段。
2. 顺劈斩纯化的表达载体，并在一个适当的反应缓冲区选择的限制性内切酶的PCR片段。净化结扎前产品。
3. 结扎包含感兴趣的基因的表达载体的限制ABDz1片段，连接产物转化至E.大肠杆菌 （RR1ΔM15应变，在原来的方法是^使用 8） 。推广转化辅以选择合适的抗生素的琼脂平板上的细胞。
4. PCR扩增屏幕几个殖民地和序列验证通过DNA测序的结果表达盒。
5. 准备质粒序列verif过夜培养IED的殖民地，转化为首选的表达菌株（在原来的方法大肠杆菌罗塞塔（DE3），质粒，以改善人类基因编码的蛋白质的生产托管pRARE，被用来）。

2。蛋白表达

1. 单一菌落接种到5 g / L酵母提取物和适当的抗生素辅以胰蛋白酶大豆肉汤10毫升。在150 RPM孵育37℃过夜。
2. 在100毫升的新鲜培养基接种1毫升过夜培养，当细胞达到对数生长期，诱导蛋白表达（异丙基-β- D -半乳糖苷时，lac操纵子是利用原来1毫米）。
3. 在150转离心25 ° C过夜和收获细胞孵育。

3。正交亲和纯化

1. 在25毫升的运行缓冲液（的Tris - HCl 25毫米，200毫米氯化钠，1毫米EDTA，0.05％（W / V）吐温20，pH值8.0）重悬沉淀和扰乱次通过超声Ë细胞在60％的幅度1.0/1.0脉冲为3分钟。离心机的样品和筛选靶蛋白，含上清（0.45微米），然后再进一步净化。
2. 平衡1毫升血清白蛋白琼脂糖凝胶柱或NHS活化的列，用10个柱体积（CV）的1毫升/分钟运行在一个合适的蛋白质纯化系统的缓冲区的前面加上与HSA根据供应商的建议，。细菌裂解液0.5毫升/分钟的负载，然后复位1毫升/分钟的流速。
3. 洗5 5洗涤液的简历（5毫米_{NH 4} AC，pH值5.5）的运行缓冲液的简历列。
4. 洗脱缓冲液1毫升/分钟（0.5米的HAc，pH值2.5）洗脱样品，收集馏分，显示器在280 nm处的吸收，选择分数为进一步净化洗脱峰。
5. 池与蛋白浓度最高的分数，当然运行缓冲稀释2倍（20毫米，150毫米氯化钠，pH 7.2磷酸）和确保pH值大约是中性的。新增1个M的Tris - HCl pH值为8，增加pH值，如有必要，。
6. 1毫升HiTrap MabSelect当然列已在1毫升/分钟与10 CV当然运行缓冲平衡，负载在0.5毫升/分钟的样品。重设流速为1毫升/分钟加载后。
7. 5确保运行缓冲的简历（步骤5）洗柱和洗脱的蛋白质与0.2 M醋酸，pH值2.7。对于敏感的目标蛋白质的洗脱液可以瓦解后，收集直接由添加的Tris - HCl。

确定，如果色谱的步骤是颠倒洗脱液的MabSelect列可以运行缓冲液（步骤3.1）稀释，pH值增加了1米的Tris - HCl此外，约8。在一般情况下，窄峰时受雇于在第二个步骤是确保矩阵。

4。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS - PAGE电泳纯度评价）

1. 负载上的纯化组分降低SDS - PAGE和，如果需要，通过质谱分析纯化产物的分子量。重要的是要充分降低的样本，因为在ABDz1免费半胱氨酸可能会导致非还原条件​​下的产品二聚。

5。代表性的成果：

作为一项原则的证明，正交亲和纯化的ABDz1标签促进三个人类的目标，代表不同的溶解度类，分子量和等电点（见表1）的蛋白质进行了评估。 ABDz1基因基因融合靶基因在大肠杆菌中表达和结构，图2显示了在连续的方法的所有步骤的流程图。经净化正交协议，在不同的点采集的样品进行了分析，通过SDS - PAGE（图3）。结果清楚地表明了双标记和两个非常具体的纯化步骤的效用。即使合理的纯度是AChieved从凝胶的初步净化步骤后，连续步骤产生非常纯净的产品，非常适合要求极高的应用。

图1：用于选择双功能ABDz1标签的组合库设计。
46个氨基酸的白蛋白结合成一个稳定的三螺旋束域的褶皱和它包含了人血清白蛋白的结合位点主要位于第二个螺旋。通过基因随机11个表面暴露在位于第一和第三的螺旋氨基酸，一种新型的具有约束力的表面工程。图中的11个职位表示，和编号Kraulis等。 。以下对金黄色葡萄球菌蛋白的Z域噬菌体表达的组合库，ABDz1的双功能分子被认定二聚体biopanning。

图2正交亲和纯化协议的一个简化的流程图。
一个PCR片段包含ABDz1序列结扎（N端）与有兴趣在一个合适的表达载体的基因。结扎的产品转化为E 。序列验证和质粒制备的大肠杆菌。下面的转换表达宿主，一个大规模的重组蛋白表达的文化是从最初的过夜培养。离心收集细菌，超声裂解产生含有靶蛋白的细菌裂解。经过过滤的步骤，以去除残留的固体颗粒，液体处理系统受到裂解经历连续两个纯化步骤正交亲和纯化。洗脱峰从两个纯化步骤采样，并通过SDS - PAGE进行评估，以评估纯度和比到T他裂解纯化前。

图3。ABDz1在融合表达和纯化目标蛋白质的SDS - PAGE分析。
从融合ABDz1，代表不同的属性，和ABDz1标签本身所表达的三种蛋白的细菌裂解的样品采集，连同相应的山峰上的HSA柱净化样品由MabSelect肯定列（一） 。泳道1-4代表从裂解液净化，5-8车道从HSA的净化（第一步）和9-12的MabSelect肯定净化（第二步）车道前的样品。样品的加载顺序如下：ABDz1 - 141377，ABDz1 HT875，ABDz1 HT2375和ABDz1。此外，从纯化，以相反的顺序相同的列相同的裂解物获得的样本进行了分析（二）。泳道1-3代表从裂解物样品之前，净化，车道4-6 fROM MabSelect肯定净化（第一步）和7-9车道从HSA的净化（第二步）。样品被装在相同的顺序（一），但不包括标签本身。从这些结果很明显，这两个步骤的方法可以得到高度纯化的蛋白质，无论在其中的步骤的应用顺序。

名称 B	靶蛋白 Uniprot 彗星	分子 重量（KDA）	可溶性 D 类	分子量 融合的产物（KDA）	等电点 融合的产物
141377	B7Z315	17.4	4	23.7	8.5
HT875	P01040	10.8	3	17.1	4.9
HT2375	P00740	8.9	5	15.2	6.8

1. ABDz1标签单独的分子量为6.3 kDa的，等电点为6.7。
2. 目标蛋白质表示的Uniprot蛋白质的一部分。
3. http://www.uniprot.org 。
4. 溶解度类蛋白N -端片段他的_6个总部基地^10。

表1。 ABDz1标记靶蛋白与融合产品^的一个评估的原则，研究证明。

正交亲和力的方式，选择不同的分子量，溶解度，等电点的三个独特的人体蛋白质的表达和纯化。

讨论

这里介绍的正交亲和纯化的协议，使广泛的靶蛋白的高效净化。通过与白蛋白结合域新的结合表面的结合位点相结合的内在，开发一个小的双功能蛋白标记。它是非常简单的使用标签，因为它可以简单地克隆和融合表达任何蛋白质的首选任何表达载体的兴趣。在大多数实验室提供的标准设备，可受聘为两个步骤的蛋白质纯化。由于ABDz1标签的功能取决于有效地揭露其两个结合面域的正确折叠，方法是有限的可溶形式表达的蛋白质和不适合在变性条件下纯化。还原剂也应避免，因为它们干扰ABDz1约束力MabSelect当然矩阵z域。

正交亲和纯化TION提供了一个有用的替代传统的方法，以满足高度纯化的蛋白质在许多苛刻的应用要求。同时，这种方法不再需要时连续使用不同的净化策略组合标记。对于需要一个本地的靶蛋白的应用程序，一种蛋白酶裂解位点可能出台使酶去除^ABDz1标签可能11。此外，ABDz1标签所述的第一双特异性小而折叠的蛋白质结构域。它是独一无二的，因为它提供了一个净化战略，取决于两个目标的具体亲和力相互作用。在未来，这将是有趣扩大这个概念，开发新的双功能标签，进行与现成的和廉价的色谱树脂兼容的新的具有约束力的表面。例如，通过参与白蛋白结合的氨基酸取代基本的残留物，一个标签与I兼容交换层析可能实现的。类似的概念已被证明有效的Z域由负责工程，分别生成已知标记为Z _酸 ¹²和Z _基本 ¹³兼容阴离子和阳离子交换。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号
E.大肠杆菌 RR1ΔM15	美国典型培养物保藏	35102
E.大肠杆菌罗塞塔（DE3）	Novagen公司	70954
胰蛋白酶大豆肉汤	DIFCO	211822
酵母提取物	DIFCO	212720
振动细胞sonicator	超音速队和材料	-
HSA的琼脂糖凝胶	法玛西亚生物技术	前产品
HiTrap MabSelect当然	GE医疗集团	11-0034-93
HiTrap NHS活化HP列	GE医疗集团	17-0716-01