Protein Purification Orthogonal Animé par une étiquette d'affinité bispécifiques petits

Résumé

Un roman et très efficace en deux étapes chromatographie d'affinité protocole a été élaboré et est décrite en détail. La méthode est basée sur une petite étiquette de purification avec deux affinités inhérentes et est applicable à un large éventail de protéines cibles avec des propriétés différentes.

Résumé

En raison des coûts élevés associés à la purification de protéines recombinantes les protocoles doivent être rationalisées. Pour haut-débit efforts, il existe une demande pour des méthodes générales qui ne nécessitent pas l'optimisation des protéines cibles spécifiques ^1. Pour y parvenir, les balises de purification qui peut être génétiquement fusionné au gène d'intérêt sont couramment utilisés ^2. La poignée de l'affinité la plus largement utilisée est la balise hexa-histidine, qui est approprié pour la purification de fois dans des conditions natives et dénaturantes ^3. La charge métabolique pour la production de la balise est faible, mais il ne fournit pas que la spécificité élevée que chromatographie d'affinité ^1,2 concurrentes stratégies.

Ici, une étiquette de purification bispécifique avec deux différents sites de fixation sur un acide aminé 46, le domaine petite protéine a été développée. Le domaine d'albumine contraignant est dérivé de la protéine G streptococcique et a une forte affinité inhérente à l'albumine sérique humaine(HSA). Onze exposées à la surface des acides aminés, ne participent pas à l'albumine contraignant ^4, ont été randomisés pour produire génétiquement une bibliothèque combinatoire. La bibliothèque de protéines avec le roman disposées au hasard de surface de liaison (figure 1) ont été exprimées sur les particules de phages pour faciliter la sélection des liants par la technologie d'affichage de phages. Grâce à plusieurs cycles de biopanning contre un dimère Z-domaine dérivé de la protéine staphylococcique A ^5, une petite molécule bispécifique avec une affinité pour les deux HSA et la nouvelle cible a été identifié ^6.

Le domaine nouvelle protéine, appelée ABDz1, a été évaluée comme une étiquette de purification pour une sélection de protéines cibles avec des poids moléculaires différents, la solubilité et le point isoélectrique. Trois protéines cibles ont été exprimés dans Escherichia Escherishia avec le tag roman fusionnée à leur N-terminaux et par la suite purifiés par affinité. La purification initiale soit sur une colonne avec immobilisé HSA ou Z-domaine conduit à relativement des produits purs. Deux étapes de purification par affinité avec le tag bispécifique conduit à une amélioration substantielle de la pureté des protéines. Supports chromatographiques avec le Z-domaine immobilisées, par exemple MabSelect sûr, sont facilement disponibles pour la purification des anticorps et des HSA peuvent être facilement couplés chimiquement à des médias pour fournir la deuxième matrice.

Cette méthode est particulièrement avantageux quand il ya une forte demande sur la pureté de la protéine cible récupéré. Le bifonctionnalité de la balise permet à deux différentes étapes de chromatographie pour être utilisés pendant le fardeau métabolique sur l'hôte d'expression est limitée en raison de la faible taille de l'étiquette. Il offre une alternative compétitive à ce qu'on appelle le marquage combinatoire, où plusieurs balises sont utilisées en combinaison ^1,7.

Protocole

1. Clonage de la fusion de cibles gene/ABDz1-tagged construire

1. Préparer des fragments PCR du gène ABDz1 flanqué par des sites de restriction appropriée pour N-terminal de la ligature du gène cible dans le plasmide d'expression (un plasmide contenant ABDz1 est disponible gratuitement grâce à un accord de transfert de matériel).
2. Enchaînement d'expression purifiée vecteur et fragments PCR avec des enzymes de restriction choisies dans un tampon de réaction appropriée. Purifier les produits avant la ligature.
3. Ligaturer les restreint ABDz1 fragment dans le vecteur d'expression contenant le gène d'intérêt et de transformer le produit de ligature à E. coli (dans la méthode originale la souche RR1ΔM15 a été utilisé ^8). Fais cellules transformées sur des plaques d'agar supplémenté avec des antibiotiques appropriés pour la sélection.
4. PCR écran un peu de colonies et la séquence de vérifier la cassette d'expression résultant par séquençage d'ADN.
5. Préparer plasmidique à partir d'une culture de nuit d'une séquence verifcolonie IED et de transformer la souche d'expression préféré (dans la méthode de E. coli d'origine Rosetta (DE3), organise un PRARE plasmidique pour améliorer la production des protéines codées par les gènes humains, ont été utilisés).

2. L'expression des protéines

1. Inoculer une seule colonie bactérienne dans 10 ml de bouillon de soja tryptique supplémenté avec 5 extrait de levure g / l et des antibiotiques appropriés. Incuber à 150 rpm à 37 ° C pendant la nuit.
2. Inoculer 1 ml de culture de la nuit dans 100 ml de milieu frais et d'induire l'expression des protéines (à l'origine une mM d'isopropyl-β-D-thiogalactoside quand un opéron lac a été utilisé) quand les cellules atteignent la phase de croissance logarithmique.
3. Incuber à 150 rpm à 25 ° C durant la nuit les cellules et la récolte par centrifugation.

3. Purification par affinité orthogonale

1. Reprendre le culot dans 25 ml de tampon de fonctionnement (25 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,05% (p / v) de Tween 20, pH 8,0) et perturber èmee cellules par sonication à une amplitude de 60% et 1.0/1.0 impulsions pendant 3 min. Centrifuger l'échantillon et le filtre de la protéine cible contenant surnageant (0,45 um) avant une purification supplémentaire.
2. Equilibrer soit un 1 ml HSA Sépharose colonne ou une colonne de NHS-activated, précédemment couplé avec HSA selon les recommandations du fournisseur, avec 10 volumes de colonne (CV) de course de tampon à 1 ml / min sur un système de purification de protéines adéquat. Chargez le lysat bactérien à 0,5 ml / min, puis remettre le débit à 1 ml / min.
3. Laver la colonne avec 5 CV de tampon de migration suivies de 5 CV de tampon de lavage (5 mM NH ₄ Ac, pH 5,5).
4. Eluer l'échantillon avec le tampon d'élution (0,5 M HAC, pH 2,5) à 1 ml / min et de recueillir des fractions, l'absorption à 280 nm suivre pour sélectionner les fractions du pic élué d'une purification supplémentaire.
5. Piscine les fractions avec la plus forte concentration de protéines, diluer deux fois en tampon de migration Sure (phosphate 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2) etAssurez-vous que le pH se situe autour de neutre. Ajouter 1 M Tris-HCl pH 8 pour augmenter le pH si nécessaire.
6. Chargez l'échantillon à 0,5 ml / min sur une colonne de 1 ml MabSelect HiTrap SuRe qui a été équilibrée avec 10 CV de tampon de migration sûr à 1 ml / min. Réinitialiser le débit à 1 ml / min après le chargement.
7. Laver la colonne avec 5 CV de tampon de migration Sure (étape 5) et éluer les protéines avec 0,2 M HAC, pH 2,7. Pour les protéines cibles sensibles de l'éluat peut être neutralisé directement sur la collecte par addition de Tris-HCl.

Si les étapes chromatographiques sont inversés l'éluat de la colonne de MabSelect sûr qu'il puisse être dilués dans un tampon (étape 3.1) et l'augmentation du pH à environ 8 par addition de 1 M Tris-HCl. En général, plus étroit pics sont observés lorsque la matrice Sure est employé dans la deuxième étape.

4. Evaluation de la pureté par électrophorèse sur gel de sulfate de sodium dodécyl polyacrylamide (SDS-PAGE)

1. Chargez les fractions purifiées sur uneréduire SDS-PAGE et, si désiré, d'analyser le poids moléculaire du produit purifié par spectrométrie de masse. Il est important de réduire complètement l'échantillon depuis une cystéine libre dans ABDz1 peut provoquer la dimérisation du produit sous conditions non réductrices.

5. Les résultats représentatifs:

Comme une preuve de principe, de purification par affinité orthogonale facilitée par la balise ABDz1 a été évaluée pour trois protéines cibles humaines représentant les classes de solubilité différentes, des poids moléculaires et points isoélectriques (tableau 1). Le gène a été génétiquement fusionné ABDz1 aux gènes cibles et les constructions ont été exprimées dans E. coli, la figure 2 montre un organigramme pour toutes les étapes de la méthode consécutivement. Après purification par le protocole orthogonales, les échantillons prélevés à différents points ont été analysés par SDS-PAGE (figure 3). Les résultats montrent clairement l'utilité d'une balise double et deux étapes de purification très spécifique. Même si la pureté raisonnable est achieved après l'étape de purification initiale comme on le voit à partir des gels, l'étape successive donne un produit très pur bien adapté pour des applications très exigeantes.

Figure 1. Conception de la bibliothèque combinatoire utilisée pour la sélection de l'bispécifique ABDz1 tag.
Les 46 acides aminés se replie de domaine albumine contraignant dans un bundle stable à trois hélices et il contient un site de liaison pour l'albumine sérique humaine principalement situés à la deuxième hélice. Par génétiquement aléatoire onze surface exposée acides aminés situés dans la première hélice et de la troisième, une surface nouvelle liaison était conçu. Les onze positions sont indiquées sur la figure et numérotés selon Kraulis et al. ^9. Après biopanning contre un dimère de la Z-domaine de la protéine A du staphylocoque à la bibliothèque combinatoire exprimé sur phage, la molécule bispécifique ABDz1 a été identifié.

Figure 2. Un organigramme simplifié pour le protocole de purification par affinité orthogonale.
Une PCR-fragment contenant la séquence ABDz1 est ligaturé (N-terminale) avec un gène d'intérêt dans un vecteur d'expression approprié. Le produit de ligation est transformé en E. coli pour la vérification de séquence et préparation de plasmide. Suite à la transformation d'un hôte d'expression, d'une culture à grande échelle pour l'expression de protéines recombinantes est mis en place à partir d'une culture initiale pendant la nuit. Les bactéries sont récoltées par centrifugation et lysées par sonication pour produire lysat bactérien contenant la protéine cible. Après une étape de filtration pour éliminer les résidus de particules solides, le lysat est soumis à la purification par affinité orthogonale sur un système de manipulation des liquides en subissant deux étapes de purification dans la succession. Pics élués des deux étapes de purification sont échantillonnés et évalués par SDS-PAGE pour évaluer la pureté et par rapport à tIl lysat avant purification.

Figure 3. Analyse SDS-PAGE de protéines cibles exprimées et purifiées en fusion avec ABDz1.
Des échantillons prélevés dans le lysat bactérien de trois protéines exprimées dans la fusion à ABDz1, représentant des propriétés différentes, et la balise elle-même étaient ABDz1 collectés avec des échantillons provenant des pics correspondants provenant de la purification sur une colonne de HSA-suivi par un MabSelect Sure-colonne (A) . Pistes 1-4 représentent des échantillons à partir de lysats avant la purification, les voies de l'HSA 5-8 de purification (première étape) et les voies 9-12 de la purification MabSelect Sure (deuxième étape). Les échantillons sont chargés dans l'ordre suivant: ABDz1-141377, ABDz1-HT875, ABDz1-HT2375 et ABDz1. En outre, les échantillons acquis à partir des lysats même purifiée dans l'ordre inverse sur les mêmes colonnes ont été analysés (B). Pistes 1-3 représentent des échantillons à partir de lysats avant purification, pistes 4-6 fROM MabSelect Sure-purification (première étape) et les ruelles de 7-9 HSA-purification (deuxième étape). Les échantillons ont été chargés dans le même ordre que dans (A) mais la balise elle-même n'est pas inclus. De ces résultats, il est clair que cette méthode en deux étapes rendements protéines hautement purifiées indépendamment de l'ordre dans lequel les étapes sont appliquées.

B Nom	Protéine cible Uniprot c	Moléculaire poids (kDa)	Solubilité Classe D	Poids moléculaire du produit de fusion (kDa)	Point isoélectrique du produit de fusion
141377	B7Z315	17,4	4	23,7	8.5
HT875	P01040	10,8	3	17,1	4.9
HT2375	P00740	8.9	5	15,2	6.8

1. Poids moléculaire de ABDz1 tag seul est de 6,3 kDa, point isoélectrique 6,7.
2. Protéine cible représente une partie de la protéine Uniprot.
3. http://www.uniprot.org .
4. Classe de solubilité du fragment de la protéine N-terminal avec son ₆ ABP ^10.

Tableau 1. Protéines cibles et des produits de fusion avec ^une étiquette de ABDz1 évaluée dans une étude de validation de principe.

Trois protéines humaines uniques avec un poids moléculaire différent, la solubilité et le point isoélectrique ont été choisis pour l'expression et la purification par l'approche par affinité orthogonale.

Discussion

Le protocole de purification par affinité orthogonale présentée ici permet une purification efficace d'une large gamme de protéines cibles. En combinant le site inhérentes liaison du domaine albumine contraignant avec une surface nouvelle liaison, une petite protéine tag bispécifique a été développé. Il est très simple à utiliser la balise car il peut simplement être cloné et exprimé dans la fusion à une protéine d'intérêt dans tout vecteur d'expression privilégié. L'équipement standard disponible dans la plupart des laboratoires peuvent être employées pour la purification des protéines en deux étapes. Puisque la fonction de l'étiquette ABDz1 dépend repliement correct du domaine d'exposer efficacement ses deux surfaces de liaison, la méthode est limitée aux protéines exprimées sous forme soluble et ne conviennent pas pour des purifications dans des conditions dénaturantes. Les agents réducteurs devraient également être évités car ils interfèrent avec la liaison de ABDz1 au Z-domaine sur le MabSelect matrice sûr.

Orthogonal affinité purificationtion fournit une alternative utile aux méthodes traditionnelles afin de satisfaire les exigences de protéines hautement purifiées dans de nombreuses applications exigeantes. Dans le même temps, cette méthode élimine le besoin de marquage combinatoire lorsque des stratégies de purification différents sont utilisés dans la succession. Pour les applications nécessitant une protéine cible natif, un site de clivage de la protéase peuvent être introduits pour rendre élimination enzymatique de la balise ABDz1 possible ^11. Par ailleurs, la balise ABDz1 est le premier domaine bispécifique petite protéine et plié décrites à ce jour. Il est unique car elle fournit une stratégie de purification qui repose sur deux interactions cibles affinité spécifique. Dans l'avenir, il serait intéressant d'étendre ce concept en développant de nouvelles étiquettes qui portent bispécifique nouvelles surfaces de liaison qui sont compatibles avec facilement disponibles et peu coûteux des résines chromatographiques. Par exemple, en remplaçant les acides aminés impliqués dans la liaison albumine avec des résidus de base, un tag compatible avec isur la chromatographie d'échange peut être réalisable. Un concept similaire a été prouvé efficace par le génie chargé de la Z-domaine pour générer les balises connue sous le nom _d'acide Z ¹² et Z ¹³ _{de base} compatible avec les anions et de cations échange, respectivement.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue
E. coli RR1ΔM15	American Type Culture Collection	35102
E. coli Rosetta (DE3)	Novagen	70954
Bouillon de soja tryptique	Difco	211822
L'extrait de levure	Difco	212720
Sonicateur cellules Vibra	Sonics et les matériaux	-
HSA Sépharose	Pharmacia Biotech	Ancien produits
HiTrap SuRe MabSelect	GE Healthcare	11-0034-93
HiTrap NHS-activated colonne HP	GE Healthcare	17-0716-01