חלבון טיהור אורתוגונלית בהנחיית תג זיקה קטנים Bispecific

Summary

הרומן יעילים שני שלבים זיקה כרומטוגרפיה פרוטוקול פותחה מתואר בפירוט. השיטה מבוססת על תג טיהור קטן עם שתי זיקות מובנה ישים למגוון רחב של חלבונים יעד עם מאפיינים שונים.

Abstract

בשל העלויות הגבוהות הקשורות טיהור של חלבונים רקומביננטי הפרוטוקולים צריכים להיות רציונלית. עבור תפוקה גבוהה המאמצים יש ביקוש עבור שיטות כלליות שאינן דורשות חלבון המטרה אופטימיזציה ספציפיות ^1. כדי להשיג זאת, תגי לטיהור גנטית יכול להיות התמזגו אל הגן של עניין משמשות ^2. ידית זיקה הנפוץ ביותר הוא תג ששה היסטידין, אשר מתאים טיהור תחת שני תנאים מקומיים denaturing ^3. נטל מטבולי להפקת תג הוא נמוך, אבל זה לא מספק כמו סגוליות גבוהה כמו המתחרות ^1,2 זיקה כרומטוגרפיה אסטרטגיות מבוססות.

כאן, תג טיהור bispecific עם שני אתרי קישור שונים על חומצת אמינו 46, תחום חלבון קטן פותחה. תחום אלבומין מחייב נגזרת חלבון G סטרפטוקוקלי ויש לו זיקה חזקה הטבועה אלבומין בסרום אדם(HSA). עשר משטח חשוף חומצות אמינו, לא מעורב אלבומין מחייב ^4, חולקו באקראי גנטית כדי לייצר ספריה קומבינטורית. הספרייה חלבון עם הרומן מסודרים באופן אקראי פני השטח מחייבים (איור 1) באה לידי ביטוי על חלקיקים phage כדי להקל על הבחירה של קלסרים על ידי טכנולוגיית התצוגה phage. באמצעות מספר סבבי biopanning נגד dimeric-Z תחום הנגזרות חלבון staphylococcal ^5, מולקולה קטנה, bispecific עם זיקה הן HSA ויעד רומן זוהה ^6.

חלבון הרומן תחום, המכונה ABDz1, הוערך כתגית טיהור לבחירה של חלבונים עם יעד משקל מולקולרי מסיסות שונה, נקודת isoelectric. שלושה חלבונים היעד התבטאו coli Escherishia עם תג רומן התמזגו שלהם N-Termini ואילך זיקה מטוהרים. טיהור ראשוני על עמודה או עם HSA משותק או Z-תחום הביא relatiהמוצרים טהור vely. שני שלבים זיקה טיהור עם תג bispecific הביאו לשיפור משמעותי של טוהר חלבון. התקשורת chromatographic עם ה-Z תחום משותקת, עבור MabSelect למשל בטוח, זמינים לטיהור של נוגדנים HSA יכול בקלות להיות יחד כימית התקשורת לספק את המטריצה ​​השנייה.

שיטה זו היא יתרון במיוחד כאשר יש ביקוש גבוה על טוהר חלבון המטרה התאושש. Bifunctionality של התג מאפשר chromatographic שני צעדים שונים כדי לשמש בעוד נטל על חילוף החומרים מארח את הביטוי מוגבל בשל גודל קטן של התג. הוא מספק חלופה תחרותית עד שנקרא תיוג קומבינטורית תגי שם מרובים בשילוב ^1,7.

Protocol

1. שיבוט של היתוך היעד gene/ABDz1-tagged לבנות

1. הכן שברי PCR של הגן ABDz1 מוקף אתרי הגבלה מתאים קשירת N-מסוף הגן היעד בביטוי פלסמיד (א ABDz1 פלסמיד המכיל זמין באופן חופשי באמצעות הסכם העברת חומר).
2. קליב מטוהרים ביטוי וקטור ושברי PCR עם אנזימי הגבלה נבחר חיץ תגובה הולמת. לטהר את המוצרים לפני קשירת.
3. ולקשור שבר מוגבלת ABDz1 לתוך וקטור ביטוי המכיל את הגן של עניין להפוך את המוצר קשירת ל E. coli (בשיטה המקורית זן RR1ΔM15 שימש ^8). מורחים תאים טרנספורמציה על צלחות אגר בתוספת אנטיביוטיקה מתאימה הבחירה.
4. PCR מסך מושבות אחדות ורצף לאמת את הקלטת הביטוי וכתוצאה מכך על ידי רצפי DNA.
5. הכן פלסמיד מתרבות הלילה של verif רצףהמושבה ied ולהפוך לזן הביטוי המועדף (ב E. coli השיטה המקורית רוזטה (DE3), אירוח pRARE פלסמיד כדי לשפר את הייצור של החלבונים המקודדים על ידי הגנים האנושיים, שימשו).

2. חלבון הביטוי

1. לחסן מושבת חיידקים אחת לתוך 10 מ"ל של מרק סויה tryptic בתוספת תמצית g / l 5 שמרים אנטיביוטיקה מתאימה. דגירה בסל"ד 150 ב 37 ° C למשך הלילה.
2. לחסן 1 מ"ל של תרבות לילה בינוני 100 מ"ל ו טרי להשרות ביטוי חלבון (במקור 1 mM איזופרופיל-β-D-thiogalactoside כאשר operon החלבי נוצל) כאשר התאים מגיעים לשלב צמיחה לוגריתמי.
3. דגירה בסל"ד 150 במהירות של 25 תאים ° C במשך הלילה הקציר על ידי צנטריפוגה.

3. זיקה אורתוגונלית טיהור

1. Resuspend את הכדור בתוך חיץ 25 מ"ל ריצה (25 מ"מ טריס-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.05% (w / v) Tween 20, pH 8.0) ולשבש הדואר תאים על ידי sonication ב משרעת 60% ו 1.0/1.0 פולסים דקות 3. צנטריפוגה מדגם ולסנן את חלבון המטרה המכיל supernatant (0.45 מיקרומטר) לפני טיהור נוספים.
2. לאזן בין 1 מ"ל HSA טור Sepharose או עמודה NHS פעילה, יחד בעבר עם HSA על פי המלצות של הספק, עם 10 כרכים עמודה (CV) של הפעלת המאגר ב 1 מ"ל / דקה על מערכת טיהור חלבונים מתאים. טען את lysate חיידקי ב 0.5 מ"ל / דק 'ולאחר מכן לאפס את קצב הזרימה עד 1 מ"ל / דקה.
3. לשטוף את העמודה עם קורות חיים של 5 חיץ רץ ואחריו 5 קורות חיים של חיץ כביסה (5 מ"מ NH ₄ Ac, pH 5.5).
4. Elute המדגם עם חיץ elution (0.5 מ 'HAc, pH 2.5) בשעה 1 מ"ל / דקה לאסוף את השברים, הקליטה לפקח על 280 ננומטר לבחור שברים מהפסגה eluted לטיהור נוסף.
5. בריכת שברים עם ריכוז החלבון הגבוהה ביותר, לדלל פעמיים במאגר ריצה בטח (20 פוספט מ"מ, 150 מ"מ NaCl, pH 7.2) ולוודא pH הוא בסביבות נייטרלי. הוסף 1 M טריס-HCl pH 8 להגדיל את ה-pH במידת הצורך.
6. טען את המדגם על 0.5 mL / min על טור 1 HiTrap מ"ל MabSelect בטח כי כבר equilibrated עם קורות חיים של 10 חיץ לרוץ בטח בבית 1 מ"ל / דקה. אפס את קצב הזרימה עד 1 מ"ל / דקה לאחר הטעינה.
7. לשטוף את העמודה עם קורות חיים של 5 חיץ ריצה בטח (שלב 5) ו elute את החלבונים עם 0.2 מ 'HAc, pH 2.7. עבור חלבונים יעד רגיש eluate ניתן לנטרל ישירות על ידי תוספת של טריס-HCl על האוסף.

אם הפעולות chromatographic מתהפכים eluate מ MabSelect את הטור בטח יכול להיות מדולל מפעיל המאגר (שלב 3.1) ו-pH עלה ל סביב 8 על ידי תוספת של 1 M טריס-HCl. באופן כללי, פסגות צרה הם נצפו כאשר המטריצה ​​בטח מועסק בשלב השני.

4. הערכת טוהר על ידי אלקטרופורזה dodecyl נתרן סולפט ג'ל polyacrylamide (SDS-PAGE)

1. טען את השברים מטוהרים עלהפחתת SDS-PAGE, ואם תרצה, לנתח את משקל מולקולרי של המוצר מטוהרים על ידי ספקטרומטריית מסה. חשוב להפחית באופן מלא את המדגם מאז ציסטאין חופשי ABDz1 עלול לגרום dimerization של המוצר תחת אי - הפחתת התנאים.

5. נציג תוצאות:

כהוכחה עקרוני, טיהור זיקה אורתוגונליים בהנחיית תג ABDz1 הוערך במשך שלושה חלבונים היעד האנושי המייצג כיתות מסיסות שונה, משקולות מולקולרית נקודות isoelectric (טבלה 1). הגן היה ABDz1 התמזגו גנטית הגנים היעד המבנים התבטאו החיידק, תרשים 2 מציג תרשים זרימה של כל השלבים השיטה ברציפות. לאחר טיהור ידי פרוטוקול אורתוגונליים, דגימות שנאספו בנקודות שונות נותחו על ידי SDS-PAGE (איור 3). התוצאות מראות בבירור את התועלת של תג כפולה בשני שלבים לטיהור מאוד ספציפיות. למרות טוהר סבירה achieved לאחר שלב הטיהור הראשוני כפי שניתן לראות מן הג'לים, הצעד רצופים התשואות מוצר טהור מאוד גם מתאים מאוד יישומים תובעניים.

באיור 1. עיצוב הספרייה קומבינטורית המשמש מבחר של תג ABDz1 bispecific.
46 אמינו אלבומין מחייב חומצה תחום מתקפל לחבילה של שלושה יציב הסליל והוא מכיל אתר קשירה עבור אלבומין בסרום האדם נמצא בעיקר הסליל השני. עד גנטית אקראי eleven משטח חשוף חומצות אמיניות הממוקם הסליל הראשון והשלישי, משטח מחייב הרומן תוכנן. באחת עשרה תפקידים מצוינים באיור ממוספרות לפי Kraulis et al. ^9. בעקבות biopanning נגד דימר של תחום-Z של חלבון staphylococcal עם הספרייה קומבינטורית הביע על הפאג, את המולקולה bispecific ABDz1 זוהה.

באיור 2. תרשים זרימה פשוט עבור פרוטוקול זיקה אורתוגונליים טיהור.
PCR-קטע המכיל את רצף ABDz1 הוא ligated (N-סופני) עם הגן של עניין וקטור ביטוי מתאים. המוצר קשירת הופך ל E. coli לאימות רצף והכנת פלסמיד. בעקבות השינוי לארח ביטוי, תרבות בקנה מידה גדול עבור ביטוי חלבון רקומביננטי מוגדר מתרבות לילה ראשונית. חיידקים נקצרים על ידי צנטריפוגה ו lysed ידי sonication לייצר lysate בקטריאלי המכיל את חלבון המטרה. לאחר שלב הסינון כדי להסיר חלקיקים מוצקים שיורית, lysate הוא נתון טיהור זיקה אורתוגונליים על מערכת טיפול הנוזל על ידי עובר שני צעדים טיהור ברציפות. פסגות eluted משני השלבים לטיהור נדגמים הוערכו על ידי SDS-PAGE כדי להעריך את טוהר לעומת tהוא lysate לפני הטיהור.

באיור 3. SDS-PAGE ניתוח של חלבונים היעד הביע וטיהר ב היתוך עם ABDz1.
דגימות שנלקחו lysate החיידק של שלושה חלבונים ביטוי היתוך ABDz1, המייצגים תכונות שונות, ואת תג ABDz1 עצמה נאספו יחד עם דגימות הפסגות המתאימה טיהור על עמודה HSA ואחריו MabSelect בטוחה עמודה (A) . Lanes 1-4 מייצגים דגימות lysates לפני, נתיבי טיהור 5-8 מתוך טיהור HSA (השלב ​​הראשון) ואת נתיבי 9-12 מתוך טיהור MabSelect בטח (השלב ​​השני). דוגמאות נטענים, לפי הסדר הבא: ABDz1-141377, ABDz1-HT875, ABDz1-HT2375 ו ABDz1. בנוסף, רכשה דגימות מן lysates אותו מטוהרים בסדר הפוך על עמודות זהה נותחו (B). Lanes 1-3 מייצגים דגימות lysates לפני, נתיבי טיהור 4-6 וrom MabSelect טיהור בטוחה (השלב ​​הראשון) ואת הסמטאות 7-9 מתוך טיהור HSA (השלב ​​השני). דוגמאות הועמסו באותו סדר כמו ב (א) אלא את תג עצמו אינו כלול. מתוך תוצאות אלה ברור כי בשיטה זו שני שלבים התשואות חלבונים מטוהרים ללא סדר הפעולות מוחלים.

שם ב	יעד חלבון Uniprot ג	מולקולרית משקל (KDA)	מסיסות בכיתה ד	מולקולרית משקל המוצר של היתוך (KDA)	Isoelectric נקודה המוצר היתוך
141377	B7Z315	17.4	4	23.7	8.5
HT875	P01040	10.8	3	17.1	4.9
HT2375	P00740	8.9	5	15.2	6.8

1. משקל מולקולרי של תג ABDz1 לבדו הוא 6.3 kDa, הצבע isoelectric 6.7.
2. חלבון מטרה מייצג חלק של החלבון Uniprot.
3. http://www.uniprot.org .
4. מסיסות מעמד של שבר חלבון עם N-ABP מסוף ₆ שלו ^10.

טבלה 1. חלבונים יעד ומוצרי היתוך עם תג ABDz1 להעריך הוכחה במחקר העיקרון.

שלושה חלבונים אנושיים ייחודיים עם משקל מולקולרי מסיסות שונה, נקודת isoelectric נבחרו ביטוי וטיהור על ידי הגישה את הזיקה אורתוגונליים.

Discussion

הזיקה אורתוגונליים טיהור פרוטוקול המוצג כאן מאפשר טיהור יעיל של מגוון רחב של חלבונים היעד. על ידי שילוב של אתר הקישור הטבועה תחום אלבומין מחייב עם משטח מחייב רומן, תג קטן חלבון bispecific פותחה. זה מאוד פשוט לנצל את תג שכן הוא יכול פשוט לשכפל ו לידי ביטוי היתוך חלבון כלשהו של עניין וקטור כל ביטוי מועדף. ציוד סטנדרטי זמין ברוב המעבדות יכול להיות מועסק לטיהור שני שלבים החלבון. מאז פונקציה של תג ABDz1 תלוי קיפול נכון של התחום ביעילות לחשוף משטחים שני שלה מחייב, השיטה היא מוגבלת חלבונים לידי ביטוי בצורה מסיסים ולא מתאים purifications בתנאים denaturing. סוכני צמצום יש להימנע גם משום שהם מפריעים מחייב של ABDz1 לתחום-Z על המטריצה ​​MabSelect בטח.

אורתוגונלית זיקה purification מספק אלטרנטיבה יעילה בשיטות מסורתיות על מנת לספק את הדרישות של חלבונים מטוהרים מאוד יישומים תובעניים רבים. במקביל, שיטה זו מבטלת את הצורך תיוג קומבינטורית כאשר אסטרטגיות טיהור שונים משמשים ברציפות. עבור יישומים הדורשים חלבון מטרה הילידים, אתר מחשוף פרוטאז עשויים להיות הציג לעבד הסרת האנזימטית של תג ABDz1 האפשר ^11. יתר על כן, תג ABDz1 הוא התחום הראשון bispecific חלבון קטן מקופל שתואר עד כה. זה ייחודי משום שהוא מספק אסטרטגיה לטיהור תלויה בשני אינטראקציות יעד ספציפי זיקה. בעתיד זה יהיה מעניין להרחיב את הרעיון הזה על ידי פיתוח התגיות bispecific הרומן החדש מחייב לבצע משטחים התואמות שרפים chromatographic זמינה וזולה. לדוגמה, על ידי החלפת חומצות אמינו מעורב מחייב אלבומין עם שאריות בסיסיים, תג תואם iבבורסה כרומטוגרפיה ניתן להשגה. רעיון דומה הוכח יעיל על ידי הממונה על תחום הנדסת-Z כדי ליצור תגי הידוע בשם Z _חומצה ¹² ו-Z _בסיסי ¹³ תואם חילופי אניון ו קטיון, בהתאמה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי
E. coli RR1ΔM15	התרבות האמריקאית סוג אוסף	35102
E. coli רוזטה (DE3)	Novagen	70954
סויה Tryptic מרק	Difco	211822
תמצית שמרים	Difco	212720
הרטט sonicator תא	Sonics וחומרים	-
HSA Sepharose	Pharmacia ביוטק	לשעבר מוצר
HiTrap בטח MabSelect	GE Healthcare	11-0034-93
NHS המופעל HiTrap HP עמודה	GE Healthcare	17-0716-01