Purificação de Proteínas ortogonais Facilitado por um Tag Affinity Pequenas Bispecific

Resumo

Um romance e altamente eficiente em duas etapas cromatografia de afinidade protocolo foi desenvolvido e é descrita em detalhes. O método é baseado em uma tag de purificação com duas pequenas afinidades inerentes e é aplicável a uma grande variedade de proteínas-alvo com propriedades diferentes.

Resumo

Devido aos elevados custos associados com a purificação de proteínas recombinantes os protocolos precisam ser racionalizadas. Para high-throughput esforços há uma demanda por métodos gerais que não necessitam de proteína-alvo específicos de otimização ^1. Para alcançar este objectivo, tags purificação que geneticamente pode ser fundida ao gene de interesse são comumente usados ^​​2. A alça de afinidade mais utilizado é o tag hexa-histidina, que é adequado para a purificação sob as duas condições nativas e desnaturantes ^3. A carga metabólica para a produção da marca é baixo, mas ele não fornece a alta especificidade como concorrentes afinidade ^1,2 estratégias de cromatografia base.

Aqui, uma tag de purificação bispecific com dois diferentes sítios de ligação em um ácido amino 46, de domínio pequena proteína tem sido desenvolvido. O domínio de ligação de albumina é derivada de proteína G estreptocócicas e tem uma forte afinidade inerente à albumina sérica humana(HSA). Onze superfície exposta aminoácidos, que não estão envolvidos em albumina de ligação de ^4, foram randomizados geneticamente para produzir uma biblioteca combinatória. A biblioteca de proteína com o romance dispostas aleatoriamente superfície de ligação (Figura 1) foi expressa em partículas phage para facilitar a seleção de pastas pelo fago tecnologia de exibição. Através de várias rodadas de biopanning contra um dimérica Z domínio derivado da proteína estafilocócica A ^5, uma molécula pequena, bispecific com afinidade para ambos HSA eo novo alvo foi identificado ^6.

O domínio de nova proteína, denominada ABDz1, foi avaliada como uma marca de purificação para uma seleção de proteínas-alvo com peso molecular diferente, solubilidade e ponto isoelétrico. Três proteínas-alvo foram expressas em Escherichia Escherishia com a tag romance fundidos aos seus N-terminais e, posteriormente, purificadas por afinidade. Purificação inicial em uma coluna com HSA imobilizados ou Z-domínio resultou em relatiprodutos vely puro. Duas etapas de purificação de afinidade com a tag bispecific resultaram em melhoria substancial da pureza da proteína. Media cromatográfica com a Z-domínio imobilizada, por exemplo MabSelect Claro, estão prontamente disponíveis para a purificação de anticorpos e HSA pode facilmente ser quimicamente ligado a meios de comunicação para fornecer a segunda matriz.

Este método é especialmente vantajosa quando há uma alta demanda sobre a pureza da proteína-alvo recuperado. O bifunctionality da tag permite que dois diferentes passos cromatográficos para ser usado enquanto a carga metabólica no host expressão é limitada devido ao pequeno tamanho da tag. Ele fornece uma alternativa competitiva aos chamados tagging combinatória, onde várias marcas são usados ​​em combinação ^1,7.

Protocolo

1. Clonagem da fusão alvo gene/ABDz1-tagged construir

1. Prepare fragmentos de PCR do gene ABDz1 ladeado por sítios de restrição adequados para N-terminal ligadura do gene alvo na expressão plasmídeo (um plasmídeo contendo ABDz1 está disponível gratuitamente através de um acordo de transferência de material).
2. Cleave expressão purificada vector e fragmentos de PCR com enzimas de restrição escolhida em um buffer de reacção adequados. Purificar os produtos antes da ligadura.
3. Ligadura do fragmento ABDz1 restrito no vetor de expressão contendo o gene de interesse e transformar o produto ligadura para E. coli (no método original da cepa RR1ΔM15 foi usado ^8). Spread células transformadas em placas de ágar suplementado com antibióticos adequados para a seleção.
4. PCR tela algumas colónias e seqüência verificar a cassete de expressão resultante por seqüenciamento de DNA.
5. Prepare plasmídeo de uma cultura overnight de um verif seqüênciacolônia de IED e transformar a cepa expressão preferida (no método original E. coli Rosetta (DE3), que hospeda um pRARE plasmídeo para melhorar a produção de proteínas codificadas por genes humanos, foram usados).

2. Expressão da proteína

1. Inocular uma única colônia de bactérias em 10 ml de caldo tripticase soja suplementado com extrato de levedura 5 g / l, e os antibióticos apropriados. Incubar a 150 rpm a 37 ° C durante a noite.
2. Inocular 1 ml da cultura durante a noite em 100 ml de meio fresco e induzir a expressão da proteína (originalmente 1 mM isopropil-β-D-thiogalactoside quando um operon lac foi utilizado), quando as células atingem a fase de crescimento logarítmica.
3. Incubar a 150 rpm a 25 ° C durante a noite células e colheita por centrifugação.

3. Purificação de afinidade ortogonais

1. Ressuspender o pellet em 25 ml de tampão em execução (25 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,05% (w / v) Tween 20, pH 8,0) e interromper ªcélulas e por sonicação na amplitude de 60% e 1.0/1.0 pulsos por 3 min. Centrifugar a amostra e filtrar o sobrenadante contendo proteína-alvo (0,45 mm) antes de purificação suplementar.
2. Equilibrar um 1 ml HSA coluna Sepharose ou uma coluna de NHS-ativado, previamente combinada com HSA acordo com as recomendações do fornecedor, com 10 volumes de coluna (CV) de tampão de corrida em 1 ml / min em um sistema adequado de proteína de purificação. Carregue o lisado bacteriano de 0,5 ml / min e em seguida, redefinir a taxa de fluxo de 1 ml / min.
3. Lavar a coluna com 5 CV de tampão de corrida seguido por 5 CV de tampão de lavagem (5 mM NH ₄ Ac, pH 5,5).
4. Eluir a amostra com tampão de eluição (0,5 M HAc, pH 2,5) a 1 ml / min e coletar frações, a absorção de monitor em 280 nm para selecionar frações do pico eluído para purificação adicional.
5. Piscina das frações com a maior concentração de proteína, dilua duas vezes em tampão de corrida Claro (20 de fosfato mM, 150 mM NaCl, pH 7,2) ecertifique-se o pH está em torno de neutro. Adicionar 1 M Tris-HCl pH 8 para aumentar o pH, se necessário.
6. Carga da amostra em 0,5 ml / min em uma coluna de um MabSelect HiTrap ml Claro que foi equilibrado, com 10 CV de tampão de corrida Claro em 1 ml / min. Redefinir a taxa de fluxo de 1 ml / min após o carregamento.
7. Lavar a coluna com 5 CV de tampão de corrida Claro (passo 5) e eluir as proteínas com 0,2 M HAc, pH 2.7. Para as proteínas-alvo sensíveis o eluído pode ser neutralizado diretamente no momento da recolha pela adição de Tris-HCl.

Se as etapas cromatográficas são invertidos, o eluato da coluna MabSelect certeza pode ser diluído em tampão de corrida (passo 3.1) e do pH aumentou para cerca de 8 por adição de 1 M Tris-HCl. Em geral, os picos mais estreitos são observadas quando a matriz Claro é empregado na segunda etapa.

4. Avaliação de pureza por eletroforese de sódio dodecil sulfato de gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)

1. Carga das frações purificadas em umredução da SDS-PAGE e, se desejado, analisar o peso molecular do produto purificado por espectrometria de massa. É importante reduzir completamente a amostra uma vez que uma cisteína livre no ABDz1 pode causar dimerização do produto em condições não-redução.

5. Resultados representativos:

Como uma prova de princípio, a purificação de afinidade ortogonais facilitada pela tag ABDz1 foi avaliada por três proteínas alvo humano que representam as classes de solubilidade diferentes, pesos moleculares e pontos isoelétricos (Tabela 1). O gene ABDz1 foi geneticamente fundido aos genes-alvo e as construções foram expressas em E. coli, Figura 2 mostra um fluxograma para todas as etapas no método consecutivamente. Após a purificação pelo protocolo ortogonais, amostras coletadas em diferentes pontos foram analisados ​​por SDS-PAGE (Figura 3). Os resultados mostram claramente a utilidade de uma tag dupla e duas etapas de purificação altamente específicos. Apesar de pureza razoável é achieved após a etapa de purificação inicial, visto a partir do gel, o passo sucessivo produz um produto muito puro bem adequado para aplicações altamente exigentes.

Figura 1. Design da biblioteca combinatória usados ​​para a seleção do tag ABDz1 bispecific.
Os 46 aminoácidos albumina de ligação de dobras de domínio em um pacote hélice estável três e ele contém um sítio de ligação para albumina sérica humana localizadas principalmente à hélice segundo. Por geneticamente randomizing eleven superfície exposta aminoácidos localizados na hélice de primeira e terceira, uma nova superfície de ligação foi projetado. Os onze posições são indicadas na figura e numerados de acordo com Kraulis et al. ^9. Seguintes biopanning contra um dímero do Z-domínio da proteína A com a biblioteca combinatorial expressa em fago, a molécula ABDz1 bispecific foi identificado.

Figura 2. Um fluxograma simplificado para o protocolo ortogonais afinidade purificação.
A PCR de fragmento contendo a seqüência ABDz1 é ligada (N-terminal), com um gene de interesse em um vetor de expressão adequado. O produto ligadura é transformado em E. coli para a verificação de seqüência e preparação plasmídeo. Após a transformação para um host de expressão, uma cultura em grande escala para a expressão da proteína recombinante é criado a partir de uma cultura inicial durante a noite. As bactérias são colhidas por centrifugação e lisadas por sonicação para produzir lisado bacteriano contendo a proteína alvo. Depois de uma etapa de filtração para remover partículas sólidas residuais, o lisado é submetido a purificação de afinidade ortogonal em um sistema de manipulação de líquidos submetendo-se a dois passos de purificação em sucessão. Picos eluídos de ambas as etapas de purificação são amostrados e avaliados por SDS-PAGE para avaliar a pureza ea comparação com tlisado ele antes de purificação.

Figura 3. SDS-PAGE análise de proteínas-alvo expressa e purificada em fusão com ABDz1.
Amostras retiradas do lisado bacteriano de três proteínas expressas em fusão para ABDz1, representando diferentes propriedades, ea tag ABDz1 si foram coletados junto com as amostras dos picos correspondentes da purificação em uma coluna HSA-seguido por um MabSelect Claro-coluna (A) . Lanes 1-4 representam amostras de lisados ​​antes de purificação, pistas 08/05 do HSA-purificação (primeira etapa) e 12/09 pistas da purificação MabSelect Claro (segunda etapa). Amostras são carregadas na seguinte ordem: ABDz1-141377, ABDz1-HT875, HT2375-ABDz1 e ABDz1. Além disso, amostras adquiridas a partir da mesma lisados ​​purificados na ordem inversa nas mesmas colunas foram analisados ​​(B). Lanes 1-3 representam amostras de lisados ​​antes de purificação, faixas 4-6 from MabSelect purificação-Sure (primeira etapa) e 09/07 a partir de pistas HSA-purificação (segunda etapa). As amostras foram carregados na mesma ordem como em (A), mas a marca em si não está incluída. A partir desses resultados, é claro que este método de duas etapas produz proteínas altamente purificadas, independentemente da ordem em que as etapas são aplicadas.

B nome	Proteína alvo UniProt c	Molecular peso (kDa)	Solubilidade classe d	Peso molecular de produto de fusão (kDa)	Ponto isoelétrico de produto de fusão
141377	B7Z315	17,4	4	23,7	8,5
HT875	P01040	10,8	3	17,1	4,9
HT2375	P00740	8,9	5	15,2	6,8

1. Peso molecular de ABDz1 tag sozinhos é de 6,3 kDa, ponto isoelétrico 6,7.
2. Proteína-alvo representa uma parte da proteína UniProt.
3. http://www.uniprot.org .
4. Classe de solubilidade de um fragmento de proteína com N-terminal Seu _seis ABP ^10.

Tabela 1. Proteínas-alvo e produtos de fusão com ^uma tag ABDz1 avaliada em um estudo de prova de princípio.

Três únicas proteínas humanas com peso molecular diferente, solubilidade e ponto isoelétrico foram escolhidos para a expressão e purificação pela abordagem afinidade ortogonais.

Discussão

O protocolo de purificação de ortogonais afinidade apresentada aqui permite purificação eficiente de uma ampla gama de proteínas-alvo. Ao combinar o local de ligação inerente do domínio albumina de ligação com uma nova superfície de ligação, uma pequena proteína tag bispecific foi desenvolvido. É muito simples de utilizar a tag uma vez que pode simplesmente ser clonados e expressos em fusão a qualquer proteína de interesse em qualquer vetor de expressão preferida. Equipamento padrão disponível na maioria dos laboratórios pode ser empregado para a purificação de proteínas em duas etapas. Uma vez que a função da tag ABDz1 depende de dobramento correto do domínio para expor sua eficiência duas superfícies de ligação, o método é limitado a proteínas expressas na forma solúvel e não adequado para purificações em condições de desnaturação. Agentes redutores também devem ser evitados, uma vez que interfere com a ligação de ABDz1 para o Z-domínio sobre a matriz MabSelect Claro.

Ortogonais afinidade purificaçãoção fornece uma alternativa útil aos métodos tradicionais, a fim de satisfazer as exigências de proteínas altamente purificadas em muitas aplicações exigentes. Ao mesmo tempo, este método elimina a necessidade de marcação combinatória quando as estratégias de purificação diferentes são usados ​​em sucessão. Para aplicações que requerem uma proteína alvo nativo, um sítio de clivagem da protease podem ser introduzidas para tornar a remoção enzimática da tag ABDz1 possível ^11. Além disso, a tag ABDz1 é o domínio primeira proteína bispecific pequenas e dobradas descritas até o momento. Ele é único, uma vez que fornece uma estratégia de purificação que depende de duas alvo interações afinidade específica. No futuro seria interessante para expandir este conceito através do desenvolvimento de novas etiquetas bispecific que carregam novas superfícies de ligação que são compatíveis com prontamente disponíveis e baratos resinas cromatográficas. Por exemplo, substituindo os aminoácidos envolvidos na ligação da albumina com resíduos básicos, uma tag compatível com iem cromatografia de troca pode ser obtida. Um conceito similar tem se mostrado eficaz pela engenharia responsável pela Z-domínio para gerar etiquetas conhecido como _ácido Z ¹² e ¹³ _básicas Z compatível com anion e troca catiônica, respectivamente.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
E. coli RR1ΔM15	Americana Culture Collection Tipo	35102
E. coli Rosetta (DE3)	Novagen	70954
Caldo tripticase soja	Difco	211822
Extrato de levedura	Difco	212720
Vibra sonicador celular	Sonics e materiais	-
HSA Sepharose	Pharmacia Biotech	Produto ex-
HiTrap MabSelect Claro	GE Healthcare	11-0034-93
HiTrap NHS-activated coluna HP	GE Healthcare	17-0716-01