Purificazione delle proteine ​​ortogonali Facilitato da una piastrina Affinity Bispecific

Riepilogo

Un romanzo e altamente efficiente in due fasi cromatografia di affinità protocollo è stato sviluppato ed è descritto in dettaglio. Il metodo si basa su un tag purificazione con due affinità intrinseca ed è applicabile ad una vasta gamma di proteine ​​bersaglio con proprietà diverse.

Abstract

A causa dei costi elevati associati alla purificazione di proteine ​​ricombinanti i protocolli devono essere razionalizzate. Per high-throughput sforzi vi è una domanda generale per i metodi che non richiedono l'ottimizzazione specifica proteina bersaglio ^1. Per raggiungere questo obiettivo, i tag di depurazione che possono essere geneticamente fuso con il gene di interesse sono comunemente usati ^2. La maniglia affinità più usato è il esa-istidina tag, che è adatto per la depurazione sia in condizioni native e denaturanti ^3. L'onere metabolici per produrre il tag è bassa, ma non fornisce come alta specificità come concorrenti cromatografia basata ^1,2 strategie di affinità.

Qui, un tag purificazione bispecific con due diversi siti di legame su un acido 46 aminoacidi, proteine ​​piccolo dominio è stato sviluppato. L'albumina dominio di legame deriva dalla proteina G streptococco e ha una forte affinità inerente alla albumina sierica umana(HSA). Undici superficie esposta aminoacidi, non coinvolti nel legame ^albumina-4, sono stati randomizzati geneticamente per produrre una libreria combinatoria. La biblioteca di proteine ​​con il romanzo casualmente disposti superficie vincolante (Figura 1) è stato espresso sulle particelle dei fagi per facilitare la selezione dei leganti dalla tecnologia phage display. Attraverso varie tornate di biopanning contro un dimerica Z-dominio indicato da proteine ​​Staphylococcal A ^5, una piccola molecola bispecific con affinità per i HSA e il nuovo bersaglio è stato identificato ^6.

Il dominio nuova proteina, denominata ABDz1, è stata valutata come un tag di depurazione per una selezione di proteine ​​bersaglio con diverso peso molecolare, solubilità e punto isoelettrico. Tre proteine ​​bersaglio sono stati espressi in Escherichia Escherishia con il tag romanzo fusi alla loro N-termini e successivamente purificato per affinità. Purificazione iniziale su una colonna con immobilizzato HSA o Z-dominio ha portato in relazionvamente prodotti puri. In due fasi purificazione di affinità con il tag bispecific determinato un sostanziale miglioramento della purezza delle proteine. Mezzi di comunicazione cromatografica con la Z-dominio immobilizzato, per esempio MabSelect Certo, sono facilmente disponibili per la purificazione degli anticorpi e HSA può essere facilmente accoppiato chimicamente ai media per fornire la matrice secondo.

Questo metodo è particolarmente vantaggioso quando c'è una forte domanda sulla purezza della proteina bersaglio recuperato. Il bifunctionality del tag consente due diverse fasi cromatografiche da utilizzare, mentre il peso metabolico sull'host espressione è limitata a causa delle ridotte dimensioni del tag. Fornisce un'alternativa competitiva ai cosiddetti tag combinatoria dove più tag vengono utilizzati in combinazione ^1,7.

Protocollo

1. Clonazione della fusione obiettivo gene/ABDz1-tagged costruire

1. Preparare frammenti PCR del gene ABDz1 affiancato da siti di restrizione adatti per N-terminale legatura del gene target nel plasmide di espressione (un plasmide contenente ABDz1 è disponibile gratuitamente attraverso un accordo di trasferimento di materiale).
2. Cleave purificata espressione vettoriale e frammenti di PCR con enzimi di restrizione scelto in un tampone di reazione adeguato. Purificare i prodotti prima di legatura.
3. Legare il limitato ABDz1 frammento nel vettore di espressione contenente il gene di interesse e di trasformare il prodotto legatura a E. coli (nel metodo originale RR1ΔM15 ceppo è stato utilizzato ^8). Diffondere cellule trasformate su piastre di agar integrato con gli antibiotici adatti per la selezione.
4. PCR schermo alcune colonie e la sequenza verificare la cassetta espressione risultante dal sequenziamento del DNA.
5. Preparare plasmide da un giorno all'altro la cultura di una sequenza VERIFcolonia IED e trasformare al ceppo espressione preferita (in originale metodo di E. coli Rosetta (DE3), ospita un pRARE plasmide per migliorare la produzione delle proteine ​​codificate da geni umani, sono stati utilizzati).

2. Espressione della proteina

1. Inoculare una singola colonia batterica in 10 ml di brodo di soia trittico completato con 5 g / l estratto di lievito e antibiotici appropriati. Incubare a 150 rpm a 37 ° C durante la notte.
2. Seminare 1 ml di cultura durante la notte in 100 ml di mezzo fresco e indurre l'espressione della proteina (originariamente 1 mM isopropil-β-D-tiogalattoside quando un operone lac è stato utilizzato) quando le cellule raggiungono la fase logaritmica di crescita.
3. Incubare a 150 rpm a 25 ° C le cellule durante la notte e messe per centrifugazione.

3. Affinità purificazione ortogonali

1. Risospendere il pellet in 25 ml di tampone in esecuzione (25 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,05% (w / v) di Tween 20, pH 8,0) e disturbare °cellule e mediante ultrasuoni al 60% di ampiezza e 1.0/1.0 impulsi per 3 min. Centrifugare il campione e filtrare la proteina bersaglio contenente surnatante (0,45 micron) prima di un'ulteriore purificazione.
2. Equilibrare un 1 ml di HSA colonna Sepharose o un NHS-attivato colonna, precedentemente accoppiato con HSA secondo le raccomandazioni del fornitore, con 10 volumi di colonna (CV) di correre tampone a 1 ml / min su un adeguato sistema di purificazione delle proteine. Caricare il lisato batterico a 0,5 ml / min e poi ripristinare il flusso di 1 ml / min.
3. Lavare la colonna con 5 CV di tampone di corsa seguiti da 5 CV di tampone di lavaggio (5 mM NH ₄ Ac, pH 5,5).
4. Eluire il campione con tampone di eluizione (0,5 M HAC, pH 2.5) a 1 ml / min e raccogliere frazioni, monitorare l'assorbimento a 280 nm per selezionare frazioni dalla vetta eluiti per un'ulteriore purificazione.
5. Piscina le frazioni con la più alta concentrazione di proteine, diluire due volte in certi tampone di corsa (20 mM fosfato, 150 mM NaCl, pH 7,2) eassicurarsi che il pH è intorno neutro. Aggiungere 1 M Tris-HCl pH 8 per aumentare il pH, se necessario.
6. Caricare il campione a 0,5 ml / min su una colonna 1 MabSelect HITRAP ml Certo che è stata equilibrata con 10 CV di sicuro tampone di corsa a 1 ml / min. Ripristina il flusso di 1 ml / min dopo il caricamento.
7. Lavare la colonna con 5 CV di tampone di corsa sicuro (punto 5) ed eluire le proteine ​​con 0,2 M HAC, pH 2.7. Per le proteine ​​bersaglio sensibile l'eluato può essere neutralizzato direttamente al momento della raccolta con l'aggiunta di Tris-HCl.

Se i passaggi cromatografici sono invertiti l'eluato dal MabSelect colonna Certo possono essere diluiti con tampone (passo 3.1) e il pH è aumentato a circa 8 mediante aggiunta di 1 M Tris-HCl. In generale, più stretto picchi si osservano quando la matrice Certo è impiegato nella seconda fase.

4. Valutazione della purezza di sodio dodecil solfato elettroforesi su gel di poliacrilammide (SDS-PAGE)

1. Caricare le frazioni purificata su unariducendo SDS-PAGE e, se necessario, analizzare il peso molecolare del prodotto purificato mediante spettrometria di massa. E 'importante ridurre completamente il campione in quanto una cisteina libera in ABDz1 può causare dimerizzazione del prodotto in condizioni non riducenti.

5. Rappresentante dei risultati:

Come prova di principio, purificazione di affinità ortogonali facilitato dal tag ABDz1 è stato valutato per tre proteine ​​bersaglio umano che rappresentano classi di diversa solubilità, pesi molecolari e punti isoelettrico (Tabella 1). Il gene ABDz1 era geneticamente fuso con i geni bersaglio ed i costrutti sono stati espressi in E. coli, la Figura 2 mostra un diagramma di flusso per tutte le fasi del metodo consecutivamente. A seguito di purificazione dal protocollo ortogonali, campioni raccolti in diversi punti sono stati analizzati mediante SDS-PAGE (Figura 3). I risultati mostrano chiaramente l'utilità di un tag a doppia e due fasi di purificazione altamente specifiche. Anche se è ragionevole purezza achieved dopo la fase di purificazione iniziale visto dal gel, il passo successivo si ottiene un prodotto molto puro adatto per applicazioni altamente esigenti.

Figura 1. Progettazione della biblioteca combinatoria utilizzata per la selezione del bispecific ABDz1 tag.
I 46 aminoacidi albumina vincolante pieghe di dominio in una stalla tre fascio elica e contiene un sito di legame per l'albumina sierica umana principalmente trova a elica secondo. Con geneticamente randomizing undici superficie esposta amino acidi situato nel elica di prima e terza, una superficie romanzo vincolante è stato progettato. Gli undici posizioni sono indicate nella figura e numerati secondo Kraulis et al. ^9. A seguito di biopanning contro un dimero di Z-dominio della proteina A stafilococcica con la libreria combinatoria espressa fagi, il bispecific ABDz1 molecola è stata identificata.

Figura 2. Un diagramma di flusso semplificato per il protocollo di purificazione di affinità ortogonale.
Una PCR-frammento contenente la sequenza ABDz1 è legatura (N-terminale) con un gene di interesse in un vettore di espressione adatta. Il prodotto legatura si trasforma in E. coli per la verifica di sequenza e la preparazione plasmide. A seguito di trasformazione di un host espressione, una grande cultura di espressione della proteina ricombinante è costituito da una cultura iniziale durante la notte. I batteri sono raccolte per centrifugazione e lisate mediante ultrasuoni per la produzione di lisato batterico contenente la proteina bersaglio. Dopo una fase di filtrazione per rimuovere residue particelle solide, il lisato è sottoposto a purificazione di affinità ortogonale su un sistema di gestione dei liquidi, subendo due passaggi di purificazione in successione. Picchi eluiti da entrambe le fasi di purificazione sono campionati e valutate da SDS-PAGE per valutare la purezza e rispetto al tha lisato prima di purificazione.

Figura 3. SDS-PAGE analisi delle proteine ​​bersaglio espresse e purificate in fusione con ABDz1.
I campioni prelevati dal lisato batterico di tre proteine ​​espresse in fusione di ABDz1, che rappresentano diverse proprietà, e il ABDz1 tag stesso sono stati raccolti insieme con i campioni dai picchi corrispondenti dalla purificazione su una colonna HSA-seguita da un MabSelect sicuro colonna (A) . Corsie 1-4 rappresentano campioni di lisati prima purificazione, corsie 5-8 dalla HSA-purificazione (prima fase) e corsie 9-12 dalla purificazione MabSelect sicuro (seconda fase). I campioni vengono caricati nel seguente ordine: ABDz1-141377, ABDz1-HT875, ABDz1-HT2375 e ABDz1. Inoltre, i campioni acquisiti dai lisati stesso purificato in ordine inverso sulle colonne stesse sono state analizzate (B). Corsie 1-3 rappresentano campioni di lisati prima purificazione, corsie 4-6 from MabSelect Sure-purificazione (prima fase) e corsie 7-9 da HSA-purificazione (seconda fase). I campioni sono stati caricati nello stesso ordine come in (A), ma il tag non è incluso. Da questi risultati è chiaro che questo metodo in due fasi produce proteine ​​altamente purificate indipendentemente dall'ordine in cui vengono applicati i gradini.

Nome b	Proteina bersaglio UniProt c	Molecolare peso (kDa)	Solubilità Classe D	Peso molecolare di prodotto di fusione (kDa)	Punto isoelettrico di prodotto di fusione
141377	B7Z315	17,4	4	23,7	8,5
HT875	P01040	10,8	3	17,1	4,9
HT2375	P00740	8,9	5	15,2	6,8

1. Peso molecolare di ABDz1 tag da solo è di 6,3 kDa, punto isoelettrico 6.7.
2. Proteina bersaglio rappresenta una parte della proteina UniProt.
3. http://www.uniprot.org .
4. Classe di solubilità di frammenti proteici con N-terminale del suo ₆ SOA ^10.

Tabella 1. Proteine ​​bersaglio e prodotti di fusione con ABDz1 contrassegnare ^una valutazione in una prova di studio principio.

Tre proteine ​​umano unico con diverso peso molecolare, solubilità e punto isoelettrico sono stati scelti per l'espressione e la purificazione dai approccio affinità ortogonale.

Discussione

Il protocollo di purificazione di affinità ortogonale qui presentata permette la purificazione efficiente di una vasta gamma di proteine ​​bersaglio. Combinando il sito inerente vincolante del albumina dominio di legame con una superficie romanzo vincolante, un tag piccola proteina bispecific è stato sviluppato. E 'molto semplice da utilizzare il tag dato che può semplicemente essere clonato ed espresso in fusione a qualsiasi proteina di interesse in qualsiasi vettore di espressione preferito. Equipaggiamento di serie disponibile nella maggior parte dei laboratori può essere impiegato per le due fasi di purificazione delle proteine. Poiché la funzione del tag ABDz1 dipende corretto ripiegamento del dominio per esporre in modo efficiente le sue due superfici vincolanti, il metodo è limitato alle proteine ​​espresse in forma solubile e non adatto per le purificazioni in condizioni di denaturazione. Agenti riduttori dovrebbero essere evitati in quanto interferiscono con il legame di ABDz1 alla Z-dominio sulla matrice MabSelect Certo.

Ortogonali affinità depurazionezione fornisce una valida alternativa ai metodi tradizionali al fine di soddisfare le esigenze di proteine ​​altamente purificate in molte applicazioni esigenti. Allo stesso tempo, questo metodo elimina la necessità di tagging combinatorio quando le strategie di purificazione vengono utilizzati diversi in successione. Per applicazioni che richiedono una proteina nativa bersaglio, un sito di clivaggio della proteasi possono essere introdotti per rendere la rimozione enzimatica del tag ABDz1 possibili ^11. Inoltre, il tag ABDz1 è il primo dominio bispecific piccola proteina e piegato descritto fino ad oggi. E 'unico in quanto fornisce una strategia di purificazione che dipende da due interazioni affinità target specifici. In futuro sarebbe interessante estendere questo concetto attraverso lo sviluppo di nuovi tag bispecific che portano nuove superfici vincolanti che sono compatibili con resine cromatografiche prontamente disponibili e poco costoso. Per esempio, sostituendo gli aminoacidi coinvolti nel legame con l'albumina con residui di base, un tag compatibile con isulla cromatografia a scambio può essere realizzabile. Un concetto simile è stato dimostrato efficace l'ingegneria incaricato del Z-dominio per generare tag conosciuto come _acido Z ¹² e Z ¹³ _{di base} compatibile con anioni e cationi di scambio, rispettivamente.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo
E. coli RR1ΔM15	Tipo americano Culture Collection	35102
E. coli Rosetta (DE3)	Novagen	70954
Trittico di soia brodo	Difco	211822
Estratto di lievito	Difco	212720
Vibra cellula ultrasuoni	Sonics e dei materiali	-
HSA Sepharose	Pharmacia Biotech	Prodotto ex
HITRAP Certo MabSelect	GE Healthcare	11-0034-93
HITRAP NHS-attivato HP colonna	GE Healthcare	17-0716-01