Diferenciación de aislamiento, caracterización y comparativo de las células madre derivadas de la Pulpa Dental de los dientes permanentes mediante dos métodos diferentes

Resumen

El método se describe el aislamiento y caracterización de células humanas de la Pulpa Dental madre (hDPSCs) mediante el uso de cualquiera de los dos Disociación enzimática de la pulpa (DPSC-ED) O Consecuencia directa de las células madre a partir de explantes de tejido pulpar (DPSC-OG). A continuación, seguido por In vitro Diferenciación comparativo de ambos tipos de hDPSCs en odontoblastos.

Resumen

Introducción

Las células madre son células clonigénicas que poseen dos características notables, conocidas como multi-potencia y auto-renovación ^15. Entre todas las células madre con potencias diferentes replicativos, las células madre dentales como las células madre postnatales han llamado la atención en los últimos años debido a su accesibilidad, la plasticidad y alta capacidad proliferativa en comparación con otras células madre adultas ^16. Característicamente, similar a las células madre mesenquimales, células madre de pulpa dental están adheridas las células clonogénicas que tienen la capacidad de diferenciación en múltiples mesénquima y / o no-mesénquima linajes, tanto in vitro como in vivo. ^1-8,17,18 DPSCs se identifican por su expresión negativa de antígenos hematopoyéticos (por ejemplo, CD45, CD34, CD14), y la expresión positiva de CD90, CD29, CD73, CD105, CD44 y STRO ^1-19,20.

Fácil potencial obtenida con un mínimo de dolor y morbilidad hacer DPSCs humanos como una valiosafuente capaz de MSCs en comparación con las fuentes comunes, tales como células madre mesenquimales de la médula ósea ^21. En general, DPSCs se han aislado por cualquier método de derivación, es decir, la migración de las células madre a partir de explantes de tejido de pulpa (DPSC-OG) ^22-24, y / o mediante digestión enzimática (DPSC-ED) ^4,6,25. Estudios anteriores han demostrado que el método de aislamiento y las condiciones de cultivo pueden inducir diferentes poblaciones o linajes bajo pasajes in vitro ^26,27. En el caso de los dientes permanentes (pDPSCs), Huang et al puesto de manifiesto que enzimáticas pDPSCs digeridos tienen un mayor potencial de proliferación en comparación con los DPSCs superado. ²⁶ Por otra parte, en el caso de los dientes deciduos (dDPSCs), se demostró que STRO-1 y CD34 marcadores expresa más en DDPSC-DE en comparación con DDPSC-OG. Además, DDPSC-ED mostraron un aumento significativo en la tasa de mineralización definida osteo / odonto medio. ²⁷ Por lo tanto, debido al gran potencial de DPSCs en regenerative medicina, más estudios se requerirán para un mejor entendimiento de las posibles poblaciones diferentes que se derivan de diferentes métodos de aislamiento.

Aquí, era intento de introducir de manera fácil extracción de la pulpa, mediante el uso de un solo paso disco de diamante dental para facilitar el proceso de extracción de la pulpa. Por otra parte, tras el aislamiento de las células madre derivadas de la pulpa mediante la aplicación de métodos o ED OG, propiedades generales y capacidad de diferenciación entre dos grupos también fueron investigados.

Protocolo

1. Preparar la solución de enzima y medio de proliferación (PM)

1. Hacer colagenasa tipo I Solución: Pesar colagenasa tipo I (12 mg / ml) y se disuelven en 1 ml de PBS y el filtro utilizando un filtro de 0,2 micras jeringa. A continuación, colóquelo tubo de 15 ml y conservarse a -20 ° C hasta su utilización.
2. Hacer la solución de dispasa: Pesar dispasa (16 mg / ml) y se disuelven en 1 ml de PBS y el filtro utilizando un filtro de 0,2 micras jeringa. A continuación, colóquelo tubo de 15 ml y conservarse a 4 ° C hasta su utilización.
3. Hacer solución de enzima: Añadir 1 ml de colagenasa tipo I soluciones (12 mg / ml) y 1 ml de soluciones de dispasa (16 mg / ml) en el 2 ml de PBS estéril que contiene 100 mg / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina. La concentración total de dispasa y colagenasa I en el volumen final debe ser de 4 mg / ml y 3 mg / ml, receptivamente. Luego, alícuota de este volumen en a cuatro tubo de 15 ml, conteniendo cada uno 1 ml de solución de enzima. Cada tubo se podría utilizar para la digestión de pulpa uno.
4. Hacer la disolución de lavado: Añadir 100 mg / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina en PBS.
5. Hacer que los medios básicos: modificación Alfa de medio de Eagle (α-MEM) suplementado con FBS al 10% y 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina.
6. Hacer que los medios Proliferación (PM): modificación Alfa de medio de Eagle (α-MEM) suplementado con FBS al 10%, 100 mM ácido L-ascórbico 2-fosfato, 2 mM de L-glutamina, 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml estreptomicina, 0,25 mg / ml de anfotericina B.
7. Hacer que los medios odontogénicos: modificación Alfa de medio de Eagle (α-MEM) suplementado con FBS al 10%, 100 mM ácido L-ascórbico 2-fosfato, 2 mM de L-glutamina, 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 0,01 mM dexametasona, 5 mM β-glicerol fosfato, fosfato monopotásico 1,8 mM.

2. Preparar Tejido Humano Pulpa Dental para Isolatio célula madre de la pulpa dentaln

1. Normales de los terceros molares humanos se obtuvieron de los adultos (21-29 años de edad) en la Clínica Dental del Imam Ali bajo aprobadas por la junta de revisión institucional (IRB).
2. Los dientes se coloca en el medio de base (α-MEM suplementado con FBS al 10%) y se transfirieron en laboratorio a 4 ° C.
3. Bajo la condición estéril, trabajando dentro de una campana de flujo laminar biohazard, set-up se hizo uno de 100 mm placas de Petri para cada diente para ser procesado. Superficies de los dientes se limpiaron por 70% de etanol.
4. Mientras se trabaja en una de las placas Petri, diente se mantuvo por fórceps dentales y una hoja de bisturí fue utilizado para limpiar los desechos y el ligamento periodontal en las raíces.
5. Unión cemento-esmalte se redujo lentamente mediante el uso de disco esterilizado dental para revelar la cámara pulpar. Se debe considerar que el proceso de corte debe llevarse a cabo lentamente para reducir el sobrecalentamiento del tejido dental.
6. El tejido pulpar se separó suavemente de la corona y la raíz.
7. Tejido de la pulpa se cortó en trozos pequeños con la ayuda de una cuchilla de escalpelo.

3. Aislamiento Humano Pasta Dental

1. Tejidos de la pulpa fueron sometidos a la disociación enzimática de la pulpa o fruto directo de células de explantes de tejidos de celulosa para el aislamiento de hDPSCs.
2. Disociación enzimática del tejido pulpar:
   1. Pequeños trozos de tejidos de la pulpa se transfiere a la solución de enzima durante 1 hora a 37 ° C. Vortex cada 30 minutos para ayudar a romper el tejido.
   2. Después, los grandes agregados celulares se retiraron y solo suspensiones de células se obtuvieron haciendo pasar las células a través de un filtro de células 70-m.
   3. Solo suspensiones de células se centrifugaron a 1.200 rpm durante 5 min a temperatura ambiente.
   4. Los sobrenadantes se pipetearon cuidadosamente apagado y el sedimento se resuspendió en 1 ml de medio de proliferación (PM). (Nota: FBS en medio de proliferación terminar enzimática disasociación.)
   5. Solo suspensiones de células de la pulpa dental se sembró en 25 cm matraz de cultivo con ² PM y después se incubó a 37 ° C en 5% de CO _2.
   6. El medio de cultivo se cambió cada tres días hasta la confluencia celular se logró.
3. Consecuencia directa de células de explantes de tejido pulpar:
   1. Tejido de la pulpa fue picado en 1-2-mm fragmentos, y cada pieza se colocó en 25-cm ² frascos de cultivo con PM y después se incubó a 37 ° C en 5% de CO _2. Se debe considerar que el volumen total de la PM para excrecencia de célula debe ser compatible con la unión de piezas de pasta de excrecencia celular adicional (2-3 ml por matraz).
   2. El medio se cambió después de excrecencia se observó.
   3. Las células no caben en confluencia se subcultivaron en una relación de 1:4 (paso 1).

4. Inmunofenotipificación

1. 250.000 células /tubo de ambos tipos de células en el paso 3 se incubaron por PE o FITC-conjugado con anticuerpos anti-humanos con sus isotipos durante 30 min a 4 ° C en un lugar oscuro. (Nota:. La concentración de anticuerpos se aplicó de acuerdo con el protocolo de fabricación)
2. Después del tiempo de incubación, 100 l de PBS o solución de FACS dilución se añadió a cada tubo y se centrifugó a 1.200 rpm durante 5 min en un lugar oscuro.
3. Se eliminaron los sobrenadantes y sedimentos se resuspendieron en 100 l de PBS o dilución FACS en lugar oscuro.
4. Targeted marcadores de superficie (marcadores CD) fueron evaluados por BD FACSCalibur.

5. La inducción de la diferenciación de las células en DPSCs mineralizadas y cuantificado de Ensayo Rojo de alizarina S

1. DPSCs que fueron obtenidos por cualquiera de disociación enzimática de tejido de la pulpa (conocido como DPSC-ED) o excrecencia celular directa de explantes de tejido de la pulpa (DPSC-OG) fueron sub-cultivadas durante 3 pasajes.
2. Lat Paso 3, las células se sembraron en una placa de 6 pocillos a 5.000 células / pocillo.
3. En la confluencia de 60%, medio odontogénico se sustituye por PM convencional. Tres pocillos se mantuvo como un control negativo mediante la adición de medio de crecimiento.
4. Media cambian cada 3 días hasta el día 21.
5. Al día 21, se lavaron las células con PBS y se fijaron por 1 ml / pocillo de 10% de paraformaldehído durante 15 min a temperatura ambiente.
6. Entonces paraformaldehído se pipeteó cuidadosamente y las células se lavaron 3 veces (5-10 min para cada tiempo) con agua destilada H ₂ O. (Nota: Evite perturbar la monocapa.)
7. Después del lavado, 1 ml / pocillo rojo de alizarina S se añadieron durante 20 minutos a temperatura ambiente.
8. Las células se lavaron por H2O _desionizada cuatro veces (5 min por cada vez con agitación suave) para eliminar cualquier adicional rojo de alizarina.
9. 1 ml / pocillo de H ₂ O se añadieron a evitar que las células de secado.
10. Las placas se supone que ins visualespección y / o adquisición de la imagen.
11. Para el ensayo de cuantificación de rojo de alizarina S, H ₂ O se sustituye por 1 ml de 10% de ácido acético a cada pocillo de 6-así placa y se incuba durante 30 min a temperatura ambiente con agitación.
12. Entonces, monocapa de células / pocillo fueron rascado y tanto el ácido acético y las células se transfirieron a los separados 1,5 ml de microcentrífuga tubos. (Nota:. Cada pozo debe ser separado de transferencia en un tubo de ensayo es decir, tres pozos y tres pozos de control para cada grupo de ED & OG)
13. Los tubos se agitaron vigorosamente durante 30 segundos.
14. Calentar a 85 ° C durante 10 min. (Nota: para evitar la evaporación, los tubos se sellaron con parafilm.)
15. Después del calentamiento, los tubos se transfirieron a hielo durante 5 min. (Nota: Los tubos no deben abrirse hasta llegar a ser enfriado.)
16. Las suspensiones se centrifugaron a 20.000 xg durante 15 min. Mientras centrifugación, la alizarina normas rojas se hicieronarriba.

Estándar de rojo de alizarina S se prepararon diluyendo en primer lugar el tampón de dilución y utilizado para la fabricación de 2 veces la dilución sobre la base de la mesa.

De gama alta concentración de colorante

Concentración de colorante de bajo rango

2 mM

1 mM

500 mM

250 mM

125 mM

62,5 mM

31,3 mM

15,6 mM

7,8 mM

3,9 mM

1,9 mM

0,9 mM

0,4 mM

En blanco

16. Después de la centrifugación, 1 ml de sobrenadante / tubo se transfirieron a nuevos separados 1,5 ml de microcentrífuga tubos.
17. El pH se neutralizó con ~ 375 l 10% De hidróxido de amonio por tubo. (Nota: la rabia pH debe ser 4.1-4.5).
18. 150 ml de estándar y muestras (incluye pruebas por separado y controles) se añadieron en un opaco pared, fondo transparente de 96 pocillos.
19. La absorbancia se leyó a 405 nm y los valores de la DO de las muestras se compararon con trama estándar para el análisis adicional.

Resultados

1. DPSCs que fueron obtenidos por disociación enzimática (DPSC-ED) se muestran aquí, en días 10, 15,18 (Figura 1). Las colonias iniciados para formar en casi 3 a 5 días después del aislamiento.
2. DPSCs superado (DPSC-OG) se muestran en la Figura 2 en el día 5, 10, 13 y 18. Similares a fibroblastos células comenzaron a migrar de tejido de la pulpa en el matraz por paralelo ordenar por casi 5 días después de la siembra.
3. DPSCs en el paso 3 con ambos métodos se muestran en...

Discusión

Este protocolo describe el proceso de aislamiento y caracterización de hDPSCs de pulpa dental utilizando dos métodos, la disociación enzimática y la consecuencia directa de las células madre a partir de explantes de tejido de la pulpa. Además, la diferenciación in vitro de estas células en odontoblastos, se evaluó por el ensayo cuantitativo rojo de alizarina S & QPCR.

Los protocolos existentes para el aislamiento de tejido de la pulpa de los dientes humanos se ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Catálogo o Lot. número	Comentarios (opcional)
α-MEM	GIBCO	11900-073
La colagenasa tipo I	Sigma-Aldrich	C0130-100MG
Dispasa	GIBCO	17105-041
Penicilina / estreptomicina	GIBCO	15140-122
La anfotericina B	GIBCO	15290-018
Suero bovino fetal definido (FBS)	HyClone	SH30070.03
Ácido L-ascórbico 2-fosfato	Sigma	A8960-5G
L-glutamina	GIBCO	25030-024
Dexametasona	Sigma	D4902
β-glicerol fosfato disódico hidrato de sal, BioUltra	Sigma	G9422-100G
Fosfato de potasio monobásico	Sigma-Aldrich	P5655
Osteogénesis Kit de ensayo	Millipore	PS01802031
IgG2b de ratón-PE de control de isotipo	BD Pharmingen	50808088029
FITC IgG2b de ratón control del isotipo	BD Pharmingen	559532
FITC isotipo IgG1 de ratón κ	BD Pharmingen	11471471
FITC / PE de ratón anti-humano CD34/CD45	BD Pharmingen	341071
PE anti-humana de CD146	BD Pharmingen	550315
Monoclonal de ratón anti-humano CD90/FITC	Daka	00034418
PE de ratón anti-CD73 humano	BD Pharmingen	550257
Anti-h CD105/Endoglin PE	BD Pharmingen	FAB10971P
PE de ratón anti-humano CD11b/Mac1	BD Pharmingen	5553888
CD44 PE ratón anti-humano	BD Pharmingen	555479
Con solución tampón fosfato (PBS)	GIBCO	003000
70-m de células colador	Halcón	352360
0,2 micras filtro de jeringa	Millex-GV	SLGV033RB
25 cm 2 cultura matraz	Sigma-Aldrich	Z707481
			EQUIPO
BD FACSCalibur	BD	342975
Multiskan espectrofotómetro de microplacas	Thermo Scientific	51119200
Fleurcense Microscopio	Olimpo
Fluir versión del software 2.3.1