Différenciation isolement, caractérisation et comparative de l'homme dentaires cellules souches de pulpe Dérivé de dents permanentes à l'aide de deux méthodes différentes

Résumé

La méthode décrite isolement et la caractérisation de l'homme dentaires cellules souches de pulpe (hDPSCs) en utilisant soit enzymatique de la pulpe (DPSC-ED) Ou Conséquence directe de cellules souches à partir d'explants de tissus de pulpe (DPSC-OG). Suivie par In vitro Différenciation comparative des deux types de hDPSCs en odontoblastes.

Résumé

Introduction

Les cellules souches sont des cellules clonogéniques qui possèdent deux caractéristiques remarquables, appelés multi-activité et l'auto-renouvellement ^15. Parmi toutes les cellules souches avec des puissances différentes réplicatifs, les cellules souches dentaires comme les cellules souches postnatales ont attiré l'attention ces dernières années en raison de leur accessibilité, la plasticité et haute capacité de prolifération en comparaison avec d'autres cellules souches adultes ^16. De façon caractéristique, similaire aux cellules souches mésenchymateuses, cellules souches dentaires de pâte à papier sont adhérentes des cellules clonogéniques qui ont la capacité de différenciation multiple dans le mésenchyme et / ou non-mésenchyme lignées, à la fois in vitro et in vivo. ^1-8,17,18 DPSC sont identifiés par leur expression négative d'antigènes hématopoïétiques (par exemple, CD45, CD34, CD14), et l'expression positive de CD90, CD29, CD73, CD105, CD44 et STRO-1. ^19,20

Facile potentiel obtenu avec un minimum de douleur et de morbidité faire DPSC de l'homme comme un précieuxsource de pouvoir des CSM par rapport aux sources ordinaires, telles que les cellules souches de la moelle osseuse mésenchymateuses ^21. En général, DPSC ont été isolés par les deux méthodes conséquence, c'est à dire, la migration des cellules souches à partir d'explants de tissu pulpaire (DPSC-OG) ^22-24, et / ou par digestion enzymatique (DPSC-ED) ^4,6,25. Des études antérieures ont montré que la méthode d'isolement et des conditions de culture peut induire différentes populations ou lignées en vertu passages in vitro ^26,27. Dans le cas des dents permanentes (pDPSCs), Huang et al révélé que enzymatiques pDPSCs digérés ont un potentiel plus élevé par rapport à la prolifération des DPSC trop grands. ^{26 En} outre, dans le cas des dents de lait (dDPSCs), il a été démontré que STRO-1 et CD34 marqueurs exprimés plus dDPSC-ED en comparaison avec dDPSC-OG. En outre, dDPSC-ED affiché taux plus élevé de minéralisation dans définis ostéo / odonto moyen ^27. Par conséquent, en raison du potentiel exceptionnel de DPSC dans regenerative médecine, d'autres études seront nécessaires pour mieux comprendre les éventuelles différentes populations qui sont issus de différentes méthodes d'isolement.

Ici, c'était tentative d'introduire facilement de l'extraction de la pâte, à l'aide d'un disque diamanté étape dentaire afin de faciliter le processus d'extraction de la pâte. En outre, après l'isolement des cellules souches dérivées de la pâte en appliquant les méthodes ED ou OG, les propriétés générales et la capacité de différenciation entre les deux groupes ont également été étudiés.

Protocole

1. Préparer la solution enzymatique et moyennes prolifération (PM)

1. Assurez-collagénase de type I Solution: Peser la collagénase de type I (12 mg / ml) et dissoudre dans 1 ml de PBS et le filtre à l'aide d'un filtre de 0,2 um seringue. Puis placez-le tube de 15 ml et le garder à -20 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
2. Assurez-dispase Solution: Peser dispase (16 mg / ml) et dissoudre dans 1 ml de PBS et le filtre à l'aide d'un filtre de 0,2 um seringue. Puis placez-le tube de 15 ml et le garder à 4 ° C jusqu'à leur utilisation.
3. Assurez solution enzymatique: Ajouter 1 ml de collagénase de type I des solutions (12 mg / ml) et 1 ml des solutions dispase (16 mg / ml) dans le PBS stérile 2 ml contenant 100 mg / ml de pénicilline, 100 mg / ml de streptomycine. Concentration totale de dispase et collagénase I dans le volume final est de 4 mg / ml et 3 mg / ml, réceptive. Ensuite, ce volume aliquote à quatre tube de 15 ml, contenant chacun 1 ml de solution enzymatique. Chaque tube peut être utilisé pour une digestion pâtes.
4. Assurez solution de lavage: ajouter 100 mg / ml de pénicilline, 100 mg / ml de streptomycine dans le PBS.
5. Sensibiliser les médias de base: Alpha modification du milieu de Eagle (α-MEM) supplémenté avec 10% de FBS et 100 unités / ml de pénicilline, 100 mg / ml de streptomycine.
6. Faire les médias prolifération (PM): modification Alpha du milieu de Eagle (α-MEM) supplémenté avec 10% de FBS, 100 uM acide L-ascorbique 2-phosphate, 2 mM de L-glutamine, 100 unités / ml de pénicilline, 100 mg / ml streptomycine, 0,25 mg / ml d'amphotéricine B.
7. Sensibiliser les médias odontogènes: modification Alpha du milieu de Eagle (α-MEM) supplémenté avec 10% de FBS, 100 uM acide L-ascorbique 2-phosphate, 2 mM de L-glutamine, 100 unités / ml de pénicilline, 100 mg / ml de streptomycine, 0,01 uM dexaméthasone, 5 mM β-glycérol phosphate, 1,8 mM de phosphate monopotassique.

2. Préparer tissus humains pâtes dentaires pour les pâtes Isolatio cellules souches dentairesn

1. Humains normaux troisièmes molaires ont été recueillies auprès des adultes (21-29 ans) à la clinique dentaire de l'imam Ali en vertu Conseil a approuvé Institutional Review (CISR).
2. Les dents ont été placés dans le milieu basique (α-MEM supplémenté avec 10% de FBS) et ont été transférés dans le laboratoire à 4 ° C.
3. Sous l'état stérile, travaillant dans une hotte à flux laminaire biohazard, set-up a été fait une des boîtes de Pétri de 100 mm pour chaque dent à traiter. Les surfaces des dents ont été nettoyés par l'éthanol à 70%.
4. Tout en travaillant dans l'une des boîtes de Pétri, la dent a été conservé par davier et une lame de scalpel a été utilisé pour nettoyer les débris et ligament parodontal sur les racines.
5. Jonction émail-cément a été lentement coupé à l'aide de stériliser disque dentaires pour révéler la chambre pulpaire. Il doit être considéré que le processus de coupe doit être effectuée lentement pour réduire la surchauffe des tissus dentaires.
6. Tissu pulpaire a été légèrement séparée de la couronne et la racine.
7. Tissu pulpaire a été découpé en petits morceaux à l'aide d'une lame de scalpel.

3. Isolation de la pulpe dentaire humaine

1. Tissus de pâtes a subi soit la dissociation enzymatique du tissu pulpaire ou excroissance directe de la cellule à partir d'explants de tissus de pulpe pour l'isolement de hDPSCs.
2. Dissociation enzymatique du tissu pulpaire:
   1. De petits morceaux de tissus de pulpe ont été transférés dans la solution enzymatique pendant 1 heure à 37 ° C. Vortex toutes les 30 minutes pour aider à briser le tissu.
   2. Par la suite, des agrégats de cellules grandes ont été enlevés et simple des suspensions de cellules ont été obtenues par le passage des cellules à travers un tamis cellulaire de 70 uM.
   3. Unicellulaires suspensions ont été centrifugées à 1200 rpm pendant 5 min à température ambiante.
   4. Les surnageants ont été soigneusement prélevé à la pipette et le culot est remis en suspension dans 1 ml de milieu de prolifération (PM). (Remarque: FBS en milieu de prolifération fin enzymatique dissociation.)
   5. Simple suspensions de cellules de la pulpe dentaire a été ensemencé en 25 flacon de culture cm ² avec PM et ensuite incubées à 37 ° C dans 5% de CO _2.
   6. Le milieu de culture est changé tous les trois jours jusqu'à la confluence cellulaire a été atteint.
3. Conséquence directe de la cellule à partir d'explants de tissus de pulpe:
   1. Tissu pulpaire a été réduit en 1-2-mm fragments, et chaque pièce a été placée dans 25 cm ² flacons de culture avec le Premier ministre et ensuite incubées à 37 ° C dans 5% de CO _2. Il faut considérer que le volume total de la PM pour excroissance de cellules doit prendre en charge la saisie des pièces de pâte pour conséquence d'autres cellules (2-3 ml par flacon).
   2. Le milieu a été changé après excroissance a été observée.
   3. Les cellules à confluence trop grands ont été repiquées à un ratio de 1:4 (passage 1).

4. Immunophénotypage

1. 250.000 cellules /tube de deux types de cellules dans le passage 3 ont été incubées en PE ou FITC-conjugués anticorps anti-humains avec leurs isotypes pendant 30 min à 4 ° C dans un endroit sombre. (Remarque:. La concentration d'anticorps a été appliqué selon le protocole de fabrication)
2. Après le temps d'incubation, 100 pi de PBS ou de solution de dilution FACS a été ajouté à chaque tube et centrifugée à 1200 rpm pendant 5 min dans un endroit sombre.
3. Les surnageants ont été retirés et culots ont été remis en suspension dans 100 ul de PBS ou de dilution FACS dans un endroit sombre.
4. Marqueurs de surface spécifiques ciblés (marqueurs CD) ont été évalués par BD FACSCalibur.

5. L'induction de la différenciation de la DPSC dans les cellules minéralisées et quantifiés test rouge d'alizarine S

1. DPSC qui ont été obtenus soit par dissociation enzymatique du tissu pulpaire (connu sous le nom DPSC-ED) ou excroissance directe de la cellule à partir d'explants de tissu pulpaire (DPSC-OG) ont été repiquées pendant 3 passages.
2. At Passage 3, les cellules ont été la semence dans une plaque à 6 puits à 5.000 cellules / puits.
3. A confluence de 60%, moyen odontogène ont été remplacés par heure conventionnelle. Trois puits ont été resté comme un contrôle négatif en ajoutant un milieu de croissance.
4. Moyen changer tous les 3 jours jusqu'à 21 jours.
5. Au jour 21, les cellules ont été lavées avec du PBS et ont été fixés par 1 ml / puits paraformaldéhyde 10% pendant 15 min à température ambiante.
6. Puis paraformaldéhyde a été prélevé à la pipette, avec soin et les cellules ont été lavées 3 fois (5-10 min à chaque fois) à l'eau distillée H ₂ O. (Remarque: Eviter de perturber la monocouche.)
7. Après le lavage, 1 ml / puits de rouge d'alizarine S ont été ajoutés pendant 20 min à température ambiante.
8. Les cellules ont été lavées par H ₂ O déminéralisée quatre fois (5 min à chaque fois avec doux balancement) pour éliminer toute rouge Alizarine supplémentaire.
9. 1 ml / puits H ₂ O sont ajoutés pour empêcher les cellules de séchage.
10. Les plaques ont été supposés ins visuelspection et / ou d'acquisition d'images.
11. Pour le dosage de quantification Rouge d'alizarine S, H ₂ O ont été remplacés par 1 ml d'acide acétique à 10% dans chaque puits de la plaque à 6 puits et incuber pendant 30 min à température ambiante sous agitation.
12. Puis, monocouche de cellules / puits étaient gratter et à la fois l'acide acétique et les cellules ont été transférées dans les 1,5 ml séparés micro-centrifugeuse tubes. (Remarque:. Chaque puits devraient être transférées dans un puits séparés soit trois tubes à essai et trois puits de contrôle pour chaque groupe ED & OG)
13. Les tubes ont été vortexé vigoureusement pendant 30 secondes.
14. La chaleur à 85 ° C pendant 10 min. (Remarque: pour éviter l'évaporation, les tubes ont été scellés avec du parafilm.)
15. Après chauffage, les tubes ont été transférés dans la glace pendant 5 min. (Remarque: Les tubes doivent pas être ouvert jusqu'à devenir refroidi.)
16. Les suspensions ont été centrifugées à 20.000 xg pendant 15 min. Alors que la centrifugation, l'alizarine rouge normes ont été faitesvers le haut.

Norme Rouge d'alizarine S ont été préparées en diluant d'abord le tampon de dilution et utilisé pour la fabrication de 2 dilutions d'après le tableau.

Concentration de colorant High Range

Plage basse concentration de colorant

2 mM

1 mM

500 uM

250 pM

125 um

62,5 uM

31,3 uM

15,6 uM

7,8 uM

3,9 uM

1,9 uM

0,9 um

0,4 uM

Vide

16. Après la centrifugation, 1 ml de surnageant / tube ont été transférées dans de nouveaux séparés de 1,5 ml de micro-centrifugation des tubes.
17. Le pH a été neutralisé avec ~ 375 ul de 10% D'hydroxyde d'ammonium par tube. (Remarque: la rage pH doit être 4.1 à 4.5.)
18. 150 pl de la norme et des échantillons (y compris les tests distincts et contrôles) ont été ajoutés dans une paroi opaque, fond transparent plaque de 96 puits.
19. L'absorbance a été lue à 405 nm et les valeurs de DO des échantillons ont été comparés avec terrain standard pour une analyse plus approfondie.

Résultats

1. DPSC qui ont été obtenus par dissociation enzymatique (DPSC-ED) sont présentés ici au jour 10, 15,18 (figure 1). Les colonies engagées à se former sur près de 3 à 5 jours après l'isolement.
2. DPSC trop grands (DPSC-OG) sont présentés dans la figure 2 au jour 5, 10, 13 et 18. Fibroblast-like cellules ont commencé à migrer à partir de pulpe dans le ballon par commande parallèle de près de 5 jours après le semis.
3. DPSC au passage 3 en utilisant les deux métho...

Discussion

Ce protocole décrit le processus d'isolement et la caractérisation de hDPSCs de la pulpe dentaire en utilisant deux méthodes, la dissociation enzymatique et excroissance directe de cellules souches à partir d'explants de tissus de pulpe. En outre, la différenciation in vitro de ces cellules en odontoblastes, a été évaluée par dosage quantitatif Rouge d'alizarine S & QPCR.

Les protocoles existants pour isoler le tissu pulpaire de la dent humaine avai...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Catalogue ou du terrain. nombre	Commentaires (optionnel)
α-MEM	GIBCO	11900-073
Collagénase de type I	Sigma-Aldrich	C0130-100MG
Dispase	GIBCO	17105-041
Pénicilline / streptomycine	GIBCO	15140-122
L'amphotéricine B	GIBCO	15290-018
Sérum de veau fœtal défini (FBS)	HyClone	SH30070.03
Acide L-ascorbique-2-phosphate	Sigma	A8960-5G
L-glutamine	GIBCO	25030-024
Dexaméthasone	Sigma	D4902
β-glycérol phosphate hydrate de sel disodique, BioUltra	Sigma	G9422-100G
Le phosphate de potassium monobasique	Sigma-Aldrich	P5655
Ostéogenèse Assay Kit	Millipore	PS01802031
Mouse IgG2b-PE isotype contrôle	BD Pharmingen	50808088029
FITC de souris IgG2b isotype contrôle	BD Pharmingen	559532
FITC de souris IgG1 isotype κ	BD Pharmingen	11471471
FITC / PE de souris anti-humain CD34/CD45	BD Pharmingen	341071
PE anti-human CD146	BD Pharmingen	550315
Monoclonal de souris anti-humain CD90/FITC	Daka	00034418
PE de souris anti-CD73 humain	BD Pharmingen	550257
Anti-h CD105/Endoglin PE	BD Pharmingen	FAB10971P
PE de souris anti-humain CD11b/Mac1	BD Pharmingen	5553888
CD44 PE souris anti-humain	BD Pharmingen	555479
Solution tampon phosphate (PBS)	GIBCO	003000
Tamis cellulaire de 70 pm	Faucon	352360
0,2 um seringue filtre	Millex-GV	SLGV033RB
25 flacon de culture cm 2	Sigma-Aldrich	Z707481
			ÉQUIPEMENT
BD FACSCalibur	BD	342975
Multiskan microplaques Spectrophotomètre	Thermo Scientific	51119200
Microscope Fleurcense	Olympe
Flowing 2.3.1 Version du logiciel