Выделение, характеристика и сравнительный Дифференциация по правам зубных стволовых клеток, полученных из целлюлозы постоянных зубов с помощью двух различных методов

Резюме

Метод, описанный выделение и характеристика человека пульпы зуба стволовые клетки (hDPSCs), используя либо Ферментативного распада целлюлозы (DPSC-ED) Или Прямым следствием стволовых клеток из эксплантов тканей пульпы (DPSC-OG). Затем следуют В пробирке Сравнительного дифференциации обоих типов hDPSCs в одонтобластов.

Аннотация

Введение

Стволовые клетки являются клоны клеток, которые обладают двумя замечательными особенностями, известный как мульти-потенцию и самообновления ^15. Среди всех стволовых клеток с разными потенциями репликативной, стоматологические стволовые клетки, как послеродовая стволовых клеток обратили внимание в последние годы из-за их доступности, пластичности и высокой пролиферативной способностью по сравнению с другими взрослыми стволовыми клетками ^16. Характерно, похожие на мезенхимальные стволовые клетки, зубных стволовых клеток пульпы прилипшие клетки клоны, которые имеют несколько потенциал дифференциации в мезенхимы и / или не мезенхимы линий, как в пробирке и в естественных условиях. ^1-8,17,18 DPSCs идентифицируются их негативное выражение гемопоэтических антигены (например, CD45, CD34, CD14), и положительное выражение CD90, CD29, CD73, CD105, CD44 и STRO-1. ^19,20

Легко получить потенциал с минимальным боли и заболеваемости сделать человека DPSCs как ценныйсостоянии источника МСК по сравнению с обычными источниками, такими как костного мозга мезенхимальные стволовые клетки ^21. В общем, DPSCs были выделены либо результатом метода, т. е. миграции стволовых клеток из ткани пульпы эксплантов (DPSC-OG) ^22-24, и / или путем ферментативного расщепления (DPSC-ED), ^4,6,25. Предыдущие исследования показали, что метод выделения и условия культивирования могут вызывать различные группы населения или линий в пробирке под проходы ^26,27. В случае постоянных зубов (pDPSCs), Хуанг и др. показали, что ферментативные переваривается pDPSCs имеют более высокий потенциал пролиферации по сравнению с переросла DPSCs ^26. Кроме того, в случае молочных зубов (dDPSCs), было показано, что STRO-1 и CD34 Маркеры выразили более dDPSC-ED по сравнению с dDPSC-OG. Кроме того, dDPSC-ED отображаются выше скорость минерализации в определенных костно / odonto среде ^27. Таким образом, благодаря выдающимся потенциалом DPSCs в гegenerative медицины, дополнительные исследования будут необходимы для лучшего понимания возможных различных групп населения, которые получены из различных методов изоляции.

Вот, это была попытка ввести простой способ извлечения целлюлозы, используя один шаг стоматологического алмазного диска для облегчения процесса извлечения целлюлозы. Кроме того, после выделения человека целлюлозно-производные стволовых клеток с применением ЭД или OG методы, общие свойства и способность дифференциации между двумя группами были также исследованы.

протокол

1. Подготовка раствора фермента и распространения среднего (PM)

1. Сделать коллагеназы типа I Решение: Взвесить коллагеназы типа I (12 мг / мл) и растворяют в 1 мл PBS и фильтр с помощью шприца 0,2 мкм фильтр. Затем поместите его 15 мл трубки и хранить его при температуре от -20 ° C до необходимости.
2. Сделать диспазы Решение: Взвесить диспазы (16 мг / мл) и растворяют в 1 мл PBS и фильтр с помощью шприца 0,2 мкм фильтр. Затем поместите его 15 мл трубки и хранить его при температуре 4 ° C до необходимости.
3. Сделайте раствор фермента: Добавить 1 мл коллагеназы типа I решения (12 мг / мл) и 1 мл диспазы решения (16 мг / мл) в 2 мл стерильной PBS, содержащего 100 мг / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина. Общая концентрация диспазы и коллагеназы я в конечном объеме должна составлять 4 мг / мл, 3 мг / мл, в слух. Затем аликвоты этого объема на четыре 15 мл трубки, каждая из которых содержит 1 мл раствора фермента. Каждая трубка может быть использована для одного целлюлозно пищеварения.
4. Сделать моющего раствора: Добавить 100 мг / мл пенициллина, 100 мг / мл стрептомицина в PBS.
5. Сделать основные средства массовой информации: Alpha изменения среды Игла (α-MEM) с добавлением 10% FBS и 100 ед / мл пенициллина, 100 мг / мл стрептомицина.
6. Сделать распространения массовой информации (PM): Альфа изменения среды Игла (α-MEM) с добавлением 10% FBS, 100 мкМ L-аскорбиновой кислоты 2-фосфат, 2 мМ L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина, 100 мг / мл стрептомицин, 0,25 мг / мл амфотерицина B.
7. Сделать одонтогенных СМИ: Alpha изменения среды Игла (α-MEM) с добавлением 10% FBS, 100 мкМ L-аскорбиновой кислоты 2-фосфат, 2 мМ L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина, 100 мг / мл стрептомицина, 0,01 мкМ Дексаметазон, 5 мМ β-глицерин фосфат, 1,8 мМ монокалийфосфата.

2. Подготовить человека зубной ткани Целлюлоза для стоматологических Isolatio стволовых клеток Pulpп

1. Нормальный человек третьих моляров были собраны из взрослых (21-29 лет) в стоматологической клинике имама Али в рамках утвержденных совет организации (IRB).
2. Зубы были помещены в щелочной среде (α-MEM с добавлением 10% FBS) и были переданы в лабораторию при 4 ° C.
3. В стерильных условиях, работая в рамках биологической ламинаре, настройка была сделана один 100 мм чашки Петри для каждого зуба для обработки. Поверхности зубов были убраны на 70% этанола.
4. Во время работы в одном из чашках Петри, зуб был сохранен стоматологические щипцы и скальпель был использован для очистки от мусора и периодонтальной связки на корнях.
5. Cemento-эмаль перехода медленно вырезать с помощью стерилизованные стоматологические диски, чтобы показать пульпы. Следует учитывать, что процесс резки должны быть выполнены медленно, чтобы уменьшить перегрев ткани зуба.
6. Целлюлозно ткань мягко отделены от коронки и корня.
7. Целлюлозно ткань была разрезана на маленькие кусочки с помощью скальпеля.

3. Изоляция человека Стоматологическая Целлюлозно

1. Целлюлозно ткани прошли либо ферментативного распада ткани пульпы или прямым следствием клетки из ткани пульпы эксплантов для изоляции hDPSCs.
2. Ферментативной диссоциации ткани пульпы:
   1. Небольшие кусочки ткани пульпы были переведены в раствор фермента в течение 1 часа при 37 ° C. Vortex каждые 30 мин, чтобы помочь разрушение тканей.
   2. После этого, крупные агрегаты клетки были удалены, и Single-клеточной суспензии были получены путем пропускания клеток через 70-мкм ячейки фильтра.
   3. Single-клеточной суспензии центрифугировали при 1200 оборотов в минуту в течение 5 мин при комнатной температуре.
   4. Супернатанты осторожно пипеткой, а осадок повторно суспендируют в 1 мл распространения среды (PM). (Примечание: FBS в среде распространения прекратить ферментативных расдиссоциация).
   5. Single-клеточной суспензии пульпы зуба был посеян на 25 см ² колбы с культурой сообщения, а затем инкубировали при 37 ° С в 5% СО _2.
   6. Культуральную среду меняли каждые три дня, пока клетки слияния было достигнуто.
3. Прямой результат ячейки из эксплантов тканей пульпы:
   1. Целлюлозно ткань фарш в 1-2-мм фрагменты, и каждый кусок был помещен в 25-см ² колбы с культурой с вечера, а затем инкубировали при 37 ° С в 5% СО _2. Следует учитывать, что общий объем PM для вырост клеточной должны поддерживать присоединение целлюлозно пьесы для дальнейшего вырост клетки (2-3 мл на флакон).
   2. Средний был изменен после выроста наблюдается.
   3. Переросли клетки при слиянии были суб-культурных при соотношении 1:4 (отрывок 1).

4. Иммунофенотипирование

1. 250000 клеток /трубки обоих типов клеток в проход 3, насиживают PE или FITC-сопряженных анти-антител человека с их изотипов в течение 30 мин при 4 ° С в темном месте. (Примечание:. Концентрации антител был применен в соответствии с протоколом производстве)
2. После инкубационного периода, 100 мкл PBS или FACS разбавления раствора добавляли в каждую пробирку и центрифугируют при 1200 оборотов в минуту в течение 5 мин в темном месте.
3. Супернатанты были удалены и гранулы ресуспендировали в 100 мкл PBS или FACS разведения в темном месте.
4. Целевые поверхностных маркеров (CD маркеров) были оценены BD FACSCalibur.

5. Индукции дифференцировки из DPSCs в минерализованных клетки и количественные анализа ализарин красный S

1. DPSCs, которые были получены либо ферментативного распада ткани пульпы (известный как DPSC-ED), или прямым следствием клетки из ткани пульпы эксплантов (DPSC-OG) были суб-культивировали в течение 3 проходов.
2. т Прохождение 3, клетки семя в 6-луночный планшет при 5000 клеток / лунку.
3. При слиянии 60%, средний одонтогенных были заменены на обычные сообщения. Три скважины остались в качестве отрицательного контроля путем добавления питательной среды.
4. Средний меняться каждые 3 дня до 21-й день.
5. На 21 день, Клетки промывали PBS и фиксировали на 1 мл / лунку 10% параформальдегидом в течение 15 мин при комнатной температуре.
6. Тогда параформальдегида пипеткой, тщательно и клетки промывали 3 раза (5-10 мин каждый раз) с дистиллированной H ₂ O. (Примечание: Не нарушая монослоя.)
7. После промывания 1 мл / лунку ализарин красные S были добавлены в течение 20 мин при комнатной температуре.
8. Клетки промывали деионизированной H ₂ O в четыре раза (5 мин для каждого времени с нежным качалки), чтобы удалить любые дополнительные красные ализарин.
9. 1 мл / и H ₂ O были добавлены, чтобы предотвратить клетки от высыхания.
10. Планшеты Предполагается, что визуальные модулиpection и / или захвата изображений.
11. Для количественного анализа ализарин красный S, H ₂ O были заменены на 1 мл 10% уксусной кислоты в каждую лунку 6-луночный планшет и инкубировать 30 минут при комнатной температуре при встряхивании.
12. Тогда, клеточный монослой / а были царапины и как уксусная кислота и клетки были перенесены в отдельное 1,5 мл микро-пробирок. (Примечание:. Каждую лунку должно быть передача в отдельную трубу т.е. три пробных скважин и бурение трех скважин управления для каждого ED & OG группы)
13. Пробирки встряхивали энергично в течение 30 сек.
14. Нагреть до 85 ° C в течение 10 мин. (Примечание: во избежание испарения, трубы были запечатаны с парафином).
15. После отопления, трубы были переданы в лед на 5 мин. (Примечание: трубы не должна быть открыта, пока стали охлаждаться.)
16. Суспензии центрифугировали при 20000 х г в течение 15 мин. В то время как центрифугирование, ализарин красный стандарты были сделанывверх.

Стандартные ализарин красный S были получены сначала разбавления буфером для разведения и используется для изготовления 2-кратные серийные разведения на основе таблицы.

Высокая концентрация диапазон красителей

Низкая концентрация диапазон красителей

2 мМ

1 мМ

500 мкМ

250 мкМ

125 мкМ

62,5 мкм

31,3 мкм

15,6 мкм

7,8 мкм

3,9 мкм

1,9 мкМ

0,9 мкм

0,4 мкМ

Пустой

16. После центрифугирования 1 мл супернатанта / трубки были перенесены в новую отдельную 1,5 мл микро-пробирок.
17. РН нейтрализовали ~ 375 мкл 10% Гидроксида аммония в трубке. (Примечание: рН ярость должна быть 4.1-4.5).
18. 150 мкл стандартных образцов и (включает в себя отдельные испытания и контроль) были добавлены в непрозрачной стенкой, прозрачным дном 96-луночный планшет.
19. Оптическую плотность при 405 нм и OD значения из образцов по сравнению со стандартными участок для дальнейшего анализа.

Результаты

1. DPSCs которые были получены путем ферментативного диссоциации (DPSC-ED) показаны здесь в 10 день, 15,18 (рис. 1). Колонии с инициативой сформировать почти на 3 до 5 дней после изоляции.
2. Переросли DPSCs (DPSC-OG) показаны на рисунке 2 по 5 дней, 10, 13 и 18. Фибробластоподобные клетки начали мигрир?...

Обсуждение

Этот протокол описывает процесс выделение и характеристика hDPSCs из пульпы зуба с помощью двух методов, ферментативной диссоциации и прямым следствием стволовых клеток из эксплантов тканей пульпы. Кроме того, в пробирке дифференциации этих клеток в одонтобластов, оценивали с помо?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Каталог или партии. номер	Комментарии (по желанию)
α-MEM	GIBCO	11900-073
Коллагеназы типа I	Sigma-Aldrich	C0130-100мг
Диспазы	GIBCO	17105-041
Пенициллина / стрептомицина	GIBCO	15140-122
Амфотерицин	GIBCO	15290-018
Эмбриональной бычьей сывороткой определена (FBS)	HyClone	SH30070.03
L-аскорбиновой кислоты 2-фосфат	Сигма	A8960-5G
L-глютамин	GIBCO	25030-024
Дексаметазон	Сигма	D4902
β-глицерин фосфат динатриевая соль гидрат, BioUltra	Сигма	G9422-100G
Фосфат калия однозамещенный	Sigma-Aldrich	P5655
Остеогенез набор для анализа	Millipore	PS01802031
Мышь IgG2b-PE контроля изотипа	BD Pharmingen	50808088029
FITC мыши IgG2b контроля изотипа	BD Pharmingen	559532
FITC IgG1 мыши κ изотип	BD Pharmingen	11471471
FITC / PE мыши анти-человеческий CD34/CD45	BD Pharmingen	341071
PE анти-CD146 человека	BD Pharmingen	550315
Моноклональные мыши анти-человеческий CD90/FITC	Daka	00034418
PE мышиного анти-CD73 человека	BD Pharmingen	550257
Anti-ч CD105/Endoglin PE	BD Pharmingen	FAB10971P
PE мыши анти-человеческий CD11b/Mac1	BD Pharmingen	5553888
CD44 PE мыши против человека	BD Pharmingen	555479
Фосфатный буферный раствор (PBS)	GIBCO	003000
70-мкм ячейки фильтра	Сокол	352360
0,2 мкм шприц фильтр	Millex-GV	SLGV033RB
25 см 2 колбы культуры	Sigma-Aldrich	Z707481
			ОБОРУДОВАНИЕ
BD FACSCalibur	BD	342975
Multiskan планшет спектрофотометр	Thermo Scientific	51119200
Fleurcense микроскоп	Олимп
Измельчитель программного обеспечения версии 2.3.1