Differenziazione Isolamento, caratterizzazione e comparata delle cellule umane Dental Pulp staminali derivate da denti permanenti mediante due diversi metodi

Riepilogo

Il metodo descritto l'isolamento e la caratterizzazione di cellule staminali dentali umane Pulp (hDPSCs) utilizzando Dissociazione enzimatica della polpa (DPSC-DE) O Conseguenza diretta di cellule staminali da espianti di tessuto pulpare (DPSC-OG). Seguito da In vitro Differenziazione comparativa di entrambi i tipi di hDPSCs in odontoblasti.

Abstract

Introduzione

Le cellule staminali sono cellule clonogeniche che possiedono due caratteristiche notevoli, conosciuti come multi-potenza e di auto-rinnovamento ^15. Tra tutte le cellule staminali con diverse potenze replicative, le cellule staminali dentali come le cellule staminali post-natali hanno attirato l'attenzione negli ultimi anni, a causa della loro accessibilità, plasticità, e ad alta capacità proliferativa rispetto ad altre cellule staminali adulte ^16. Caratteristicamente, simili alle cellule staminali mesenchimali, cellule staminali polpa dentale sono aderenti cellule clonogeniche aventi capacità multipla differenziazione in mesenchima e / o non-mesenchima lignaggi, sia in vitro che in vivo. ^1-8,17,18 DPSCs sono identificati da la loro espressione negativa di antigeni ematopoietiche (ad esempio, CD45, CD34, CD14), e l'espressione di CD90 positivo, CD29, CD73, CD105, CD44 e STRO-1. ^19,20

Facile potenziale ottenuto con un minimo sforzo e la morbilità rendere DPSCs umani come un validosorgente in grado di MSC rispetto alle fonti ordinarie, come le cellule staminali mesenchimali del midollo ^21. In generale, DPSCs sono stati isolati da una escrescenza metodo, cioè, la migrazione di cellule staminali da espianti di tessuto pulpare (DPSC-OG) ^22-24, e / o mediante digestione enzimatica (DPSC-ED) ^4,6,25. Studi precedenti hanno dimostrato che il metodo di isolamento e condizioni di coltura possono indurre differenti popolazioni o casate sotto passaggi in vitro ^26,27. Nel caso di denti permanenti (pDPSCs), Huang et al rivelato che enzimatiche pDPSCs digeriti hanno potenziale proliferativo superiore rispetto ai DPSCs cresciuti. ²⁶ Inoltre, nel caso di denti decidui (dDPSCs), è stato dimostrato che STRO-1 e CD34 marcatori espressi più dDPSC-DE rispetto a dDPSC-OG. Inoltre, dDPSC-ED visualizzato elevato tasso di mineralizzazione in definito osteo / odonto media. ²⁷ Pertanto, a causa del potenziale eccezionale di DPSCs in rmedicina egenerative, ulteriori studi saranno necessari per una migliore comprensione delle possibili varie popolazioni che sono derivati ​​da diversi metodi di isolamento.

Qui, era tentativo di introdurre modo semplice di estrazione polpa, utilizzando uno step-disco diamantato dentale per facilitare il processo di estrazione polpa. Inoltre, dopo l'isolamento di polpa umani cellule staminali derivate mediante l'applicazione di metodi di ED o OG, proprietà generali e capacità di differenziazione tra i due gruppi sono stati studiati.

Protocollo

1. Preparare la soluzione enzimatica e medie proliferazione (PM)

1. Marca Collagenasi I Soluzione: Pesare, collagenasi di tipo I (12 mg / ml) e sciogliere in 1 ml di PBS e filtro con un filtro 0,2 micron siringa. Poi posto 15 ml tubetto e la tiene a -20 ° C fino al momento dell'uso.
2. Fai Soluzione dispasi: Pesare dispasi (16 mg / ml) e sciogliere in 1 ml di PBS e filtro con un filtro 0,2 micron siringa. Poi posto 15 ml tubetto e la tiene a 4 ° C fino al momento dell'uso.
3. Rendere soluzione enzimatica: Aggiungere 1 ml di collagenasi di tipo I soluzioni (12 mg / ml) e 1 ml di soluzioni dispasi (16 mg / ml) in 2 ml di PBS sterile contenente 100 mg / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina. Concentrazione totale di dispasi e collagenasi I in volume finale deve essere di 4 mg / ml e 3 mg / ml, ricettivamente. Quindi, in questo volume aliquota di quattro tubo 15 ml, ciascuna contenente 1 ml di soluzione di enzima. Ogni tubo potrebbe essere utilizzato per una digestione pasta.
4. Rendere soluzione di lavaggio: Aggiungere 100 mg / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina in PBS.
5. Assicurarsi che i supporti di base: Alpha modifica del mezzo di Eagle (α-MEM) addizionato con 10% FBS e 100 unità / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina.
6. Rendere il supporto proliferazione (PM): modifica Alpha di mezzo di Eagle (α-MEM) addizionato con 10% FBS, 100 mM L-ascorbico 2-fosfato, 2 mM L-glutammina, 100 unità / ml di penicillina, 100 mg / ml streptomicina, 0,25 mg / ml di amfotericina B.
7. Rendere supporti odontogene: modifica Alpha di mezzo di Eagle (α-MEM) addizionato con 10% FBS, 100 mM L-ascorbico 2-fosfato, 2 mM L-glutammina, 100 unità / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, 0,01 pM desametasone, 5 mM β-glicerolo fosfato, 1,8 mM di fosfato monopotassico.

2. Preparare umano tessuto dentale Dental Pulp per Isolatio cellule staminali della polpan

1. Normali molari umani terzi sono stati raccolti da adulti (21-29 anni di età) presso la Clinica Odontoiatrica dell'Imam Ali sotto Institutional Review Board approvato (IRB).
2. Denti sono stati inseriti nel terreno base (α-MEM supplementato con 10% FBS) e sono stati trasferiti in laboratorio a 4 ° C.
3. Sotto la condizione sterile, lavorando all'interno di una cappa a flusso laminare biohazard, set-up è stato fatto uno 100 millimetri Petri per ogni dente da trattare. Superfici dentali venivano pulite del 70% di etanolo.
4. Mentre lavora in uno dei piatti Petri, dente è stato tenuto da pinze dentali e una lama di bisturi è stato usato per pulire i detriti e legamento parodontale sulle radici.
5. Giunzione smalto-cemento è stato lentamente tagliato utilizzando sterilizzato disco dentale per rivelare la camera pulpare. Va considerato che il processo di taglio deve essere effettuata lentamente per ridurre il surriscaldamento del tessuto dentale.
6. Tessuto pulpare è stato delicatamente separato dalla corona e radice.
7. Tessuto pulpare è stato tagliato in piccoli pezzi con l'aiuto di una lama di bisturi.

3. Umano Isolamento polpa dentale

1. Pulp tessuti sono stati sottoposti sia dissociazione enzimatica del tessuto della polpa o cellule conseguenza diretta da espianti pasta tessuto per l'isolamento di hDPSCs.
2. Dissociazione enzimatica del tessuto della polpa:
   1. Piccoli pezzi di tessuti paste sono state trasferite in soluzione enzimatica per 1 ora a 37 ° C. Vortex ogni 30 minuti per rompere il tessuto.
   2. In seguito, gli aggregati a grandi cellule sono state rimosse e cella singola sospensioni sono stati ottenuti facendo passare le cellule attraverso un 70-mM filtro cella.
   3. Monocellulari sospensioni sono state centrifugate a 1200 rpm per 5 min a temperatura ambiente.
   4. Surnatanti sono stati accuratamente pipettati off e pellet è stato risospeso in 1 ml di terreno di proliferazione (PM). (Nota: FBS a medio proliferazione terminare enzimatica disciazione.)
   5. Sospensioni monocellulari di polpa dentale è stato seminato in 25 cm ² pallone di coltura con PM e poi incubate a 37 ° C in 5% CO _2.
   6. Il terreno di coltura è stato cambiato ogni tre giorni fino a quando la confluenza delle cellule è stato raggiunto.
3. Cella diretta conseguenza da espianti di tessuto pasta:
   1. Tessuto pulpare stata macinata in 1-2-millimetri frammenti, e ogni pezzo è stato posto in 25-cm ² fiasche con PM e poi incubate a 37 ° C in 5% CO _2. Si deve considerare che il volume totale del PM per conseguenza di cella deve supportare il fissaggio di pezzi paste per outgrowth cella ulteriore (2-3 ml per beuta).
   2. Medio è stato modificato dopo escrescenza è stata osservata.
   3. Le cellule erano cresciuti a confluenza sub-coltura con un rapporto di 1:4 (passaggio 1).

4. Immunofenotipizzazione

1. 250.000 cellule /tubo di entrambi i tipi di cellule nel passaggio 3 sono state incubate da PE o FITC-coniugato anti-umani coniugati con i loro isotipi per 30 min a 4 ° C al buio. (Nota:. Concentrazione di anticorpi è stato applicato secondo il protocollo fabbricazione)
2. Dopo il tempo di incubazione, 100 microlitri di PBS o soluzione di diluizione FACS è stato aggiunto a ciascuna provetta e centrifugati a 1200 rpm per 5 min in luogo buio.
3. Surnatanti sono stati rimossi e pellet sono stati risospesi in 100 pl di PBS o diluizione FACS in luogo buio.
4. Marcatori di superficie mirate (marcatori CD) sono stati valutati da BD FACSCalibur.

5. Induzione di differenziazione delle cellule in DPSCs mineralizzati e quantificata Assay Rosso alizarina S

1. DPSCs che sono stati ottenuti da una dissociazione enzimatica del tessuto pulpare (noto come DPSC-DE) o conseguenza delle cellule direttamente da espianti di tessuto polpa (DPSC-OG) sono stati sub-coltivate per 3 passaggi.
2. Lat Passage 3, le cellule sono state seme in una piastra a 6 pozzetti 5000 cellule / pozzetto.
3. Alla confluenza del 60%, medie odontogeno stati sostituiti da PM convenzionale. Tre pozzetti erano rimasti come controllo negativo aggiungendo mezzo di crescita.
4. Media ogni 3 giorni fino al giorno 21.
5. Al giorno 21, cellule sono state lavate con PBS e sono stati fissati con 1 ml / pozzetto 10% paraformaldeide per 15 min a temperatura ambiente.
6. Poi paraformaldeide stato pipettato off, cura e le cellule sono state lavate 3 volte (5-10 minuti per ogni volta) con acqua distillata H ₂ O. (Nota: evitare di disturbare il monostrato.)
7. Dopo il lavaggio, 1 ml / pozzetto di rosso alizarina S sono stati aggiunti per 20 minuti a temperatura ambiente.
8. Le cellule sono state lavate da H ₂ O deionizzata quattro volte (5 min per ogni volta con gentile dondolio) per rimuovere qualsiasi ulteriore Alizarin rosso.
9. 1 ml / pozzetto H ₂ O sono stati aggiunti per impedire alle cellule di essiccazione.
10. Le piastre sono stati assunti i componenti visivipection e / o l'acquisizione dell'immagine.
11. Per il saggio di quantificazione Rosso alizarina S, H ₂ O sono stati sostituiti da 1 ml di acido acetico 10% in ciascun pozzetto della piastra da 6 pozzetti e incubare per 30 min a temperatura ambiente con agitazione.
12. Poi, monostrato di cellule / pozzetto sono stati raschiare e sia l'acido acetico e le cellule sono state trasferite nelle distinte da 1,5 ml micro-centrifuga tubi. (Nota:. Ogni bene dovrebbe essere il trasferimento in un tubo separato vale a dire tre pozzi di prova e tre pozzi di controllo per ogni gruppo ED & OG)
13. Tubi furono vortexate energicamente per 30 sec.
14. Riscaldare a 85 ° C per 10 min. (Nota: per evitare l'evaporazione, i tubi sono stati sigillati con parafilm.)
15. Dopo il riscaldamento, i tubi sono stati trasferiti in ghiaccio per 5 min. (Nota: I tubi non devono essere aperti finché diventano raffreddato.)
16. Gli impasti sono stati centrifugati a 20.000 xg per 15 min. Mentre centrifugazione, alizarina standard Red sono stati effettuatiup.

Standard Rosso alizarina S sono state preparate prima diluendo il tampone di diluizione e usato per fare diluizioni seriali due volte in base alla tabella.

Gamma Alta concentrazione di colorante

Gamma bassa concentrazione di colorante

2 mM

1 mM

500 pM

250 pM

125 pM

62,5 pM

31,3 pM

15,6 pM

7,8 pM

3,9 pM

1,9 pM

0,9 pM

0,4 micron

Vuoto

16. Dopo la centrifugazione, 1 ml di surnatante / tubo sono state trasferite nei nuovi separati 1,5 ml micro-provette da centrifuga.
17. Il pH è stato neutralizzato con ~ 375 microlitri 10% Idrossido di ammonio per provetta. (Nota: la rabbia pH dovrebbe essere 4,1-4,5.)
18. 150 ml di standard e campioni (include test separati e controlli) sono stati aggiunti in una parete opaca, fondo trasparente piastra a 96 pozzetti.
19. L'assorbanza è stata letta a 405 nm e valori di assorbanza dei campioni sono stati confrontati con trama standard per ulteriori analisi.

Risultati

1. DPSCs che sono stati ottenuti dalla dissociazione enzimatica (DPSC-ED) sono mostrati qui a 10 giorni, 15,18 (Figura 1). Le colonie avviato per formare su quasi 3 a 5 giorni dopo l'isolamento.
2. DPSCs superato (DPSC-OG) sono mostrati nella Figura 2, il giorno 5, 10, 13 e 18. Fibroblasto-simili cellule hanno cominciato a migrare dal tessuto pulpare nel pallone da parallelo ordinazione quasi 5 giorni dopo la semina.
3. DPSCs al passaggio 3 utilizzando entrambi i metodi sono illu...

Discussione

Questo protocollo descrive il processo di isolamento e caratterizzazione di hDPSCs da polpa dentale utilizzando due metodi, dissociazione enzimatica e la conseguenza diretta di cellule staminali da espianti di tessuto pulpare. Inoltre, in vitro differenziazione di queste cellule in odontoblasti, è stata valutata mediante dosaggio quantitativo Rosso alizarina S & QPCR.

Protocolli esistenti per isolare dal tessuto pulpare dente umano era stato utilizzato diversi strumenti quali p...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Catalogo o Lotto. numero	Commenti (opzionale)
α-MEM	GIBCO	11900-073
Collagenasi tipo I	Sigma-Aldrich	C0130-100MG
Dispasi	GIBCO	17105-041
Penicillina / streptomicina	GIBCO	15140-122
Amfotericina B	GIBCO	15290-018
Siero fetale bovino definito (FBS)	HyClone	SH30070.03
L-ascorbico 2-fosfato	Sigma	A8960-5G
L-glutammina	GIBCO	25030-024
Desametasone	Sigma	D4902
β-Glicerolo sale idrato fosfato disodico, BioUltra	Sigma	G9422-100G
Potassio fosfato monobasico	Sigma-Aldrich	P5655
Osteogenesi Assay Kit	Millipore	PS01802031
Mouse IgG2b-PE isotipo di controllo	BD Pharmingen	50808088029
FITC del mouse IgG2b isotipo di controllo	BD Pharmingen	559532
Del mouse FITC IgG1 isotipo κ	BD Pharmingen	11471471
FITC / PE topo anti-umano CD34/CD45	BD Pharmingen	341071
PE anti-CD146 umano	BD Pharmingen	550315
Monoclonale murino anti-umano CD90/FITC	Daka	00034418
PE di topo anti-CD73 umano	BD Pharmingen	550257
Anti-h CD105/Endoglin PE	BD Pharmingen	FAB10971P
PE topo anti-umana CD11b/Mac1	BD Pharmingen	5553888
CD44 PE topo anti umano	BD Pharmingen	555479
Soluzione tampone fosfato (PBS)	GIBCO	003000
70-micron cella filtro	Falco	352360
0,2 micron filtro a siringa	Millex-GV	SLGV033RB
25 cm 2 cultura pallone	Sigma-Aldrich	Z707481
			ATTREZZATURE
BD FACSCalibur	BD	342975
Multiskan spettrofotometro per micropiastre	Thermo Scientific	51119200
Fleurcense Microscopio	Olimpo
Flowing Versione software 2.3.1