인간 치과 펄프의 줄기 세포의 분리, 특성화 및 비교 차별화 두 가지 방법을 사용하여 영구 치아에서 파생

요약

방법 중 하나를 사용하여 인간의 치과 펄프의 줄기 세포 (hDPSCs)의 분리 및 특성 설명 효소 분해 (DPSC-ED) 또는 직접 가지 (DPSC-OG). 그런 다음 체외에서 비교 차별화.

초록

서문

줄기 세포는 멀티 효력과 자기 갱신 ¹⁵ 두명의 놀라운 기능을 가지고 clonogenic 세포입니다. 다른 replicative의 potencies 모든 줄기 세포 중에서 출생 후의 줄기 세포와 같은 치과 줄기 세포 때문에 자신의 접근성, 소성 및 기타 성인 줄기 세포 ^16에 비해 높은 proliferative 능력의 최근 관심을 모으고있다. 특질 상, 중간 엽 줄기 세포와 유사한, 치과 펄프의 줄기 세포는 여러 차별화를 mesenchyme로 용량 및 / 또는 체외 및 생체에서 모두 비 mesenchyme lineages을 가지고 자기편 clonogenic 세포입니다. ^1-8,17,18 DPSCs에 의해 식별됩니다 자신의 부정적인 조혈 항원의 표현 (예를 들어, CD45, CD34, CD14) 및 CD90의 긍정적 인 표현, CD29, CD73, CD105, CD44 및 STRO-1. ^19,20

최소 통증 및 병적 쉽게 얻을 가능성이 valu로 인간 DPSCs을MSCS의 수 출처는 골수 중간 엽 줄기 세포 ^21로 보통 소스에 비해. 일반적으로 DPSCs는 두 가지 방법, 즉 펄프 조직 explants (DPSC-OG) ^22-24과 /이나 효소 소화 (DPSC-ED) ^4,6,25에 의한 줄기 세포의 이동에 의해 격리되었습니다. 이전 연구는 격리 방법과 문화 조건 체외 통로 ^26,27의 아래에 다른 인구 나 lineages을 일으킬 수 것으로 나타났습니다. 영구 치아 (pDPSCs)의 경우, 황 외이 효소 소화 pDPSCs이 강해 DPSCs에 비해 높은 확산 가능성이있는 것으로 밝혀졌습니다. 또한 ^26, 낙엽 치아 (dDPSCs)의 경우,이 입증 된 그 STRO-1 & CD34 마커 dDPSC-OG에 비해 dDPSC-ED에 더 많은 표현. 또한, dDPSC-ED는 정의 osteo / odonto 매체에 높은 mineralization 속도를 표시. 따라서 ^27으로 인해 연구에서 DPSCs의 뛰어난 잠재력egenerative 약을 더 연구는 서로 다른 분리 방법에서 파생됩니다 가능한 다양한 인구를 더 잘 이해해야합니다.

여기, 펄프 추출의 과정을 촉진 한 단계 치과 다이아몬드 디스크를 사용하여, 펄프 추출의 쉬운 방법을 소개하려고했습니다. 또한, ED 또는 OG 방법을 적용하여 인간의 펄프 - 파생 줄기 세포의 분리 후, 두 그룹 사이의 일반적인 특성 및 차별화 용량도 조사했다.

프로토콜

1. 효소 솔루션 및 확산 매체 (PM)를 준비

1. Collagenase 종류 나 솔루션을 만들기 : collagenase 유형 I (12 MG / ML)을 무게 0.2 μm의 주사기 필터를 사용하여 1 ML PBS와 필터에 용해. 그런 다음 15 ML 튜브를 삽입하고 필요 할 때까지 -20 ° C에 보관하십시오.
2. dispase 솔루션을 확인합니다 dispase을 펴라 (16 MG / ML) 1 ML PBS 및 필터는 0.2 μm의 주사기 필터를 사용하여 분해. 그런 다음 15 ML 튜브를 삽입하고 필요한 ° C까지 4에 보관하십시오.
3. 효소 솔루션을 확인하십시오 : 2 ML 멸균 PBS 100 MG / ML 페니실린, 100 MG / ML의 스트렙토 마이신을 포함하는으로 한 ML collagenase 유형 I 솔루션 (12 MG / ML) 1 ML dispase 솔루션을 (16 MG / ML)를 추가합니다. 최종 볼륨의 dispase과 Collagenase I의 총 농도는 receptively 4 MG / ML, 3 MG / ML,해야합니다. 그런 다음, 네 15 ML 튜브, 각 포함 1 ML 효소 솔루션에에 나누어지는이 볼륨입니다. 각 관은 한 펄프 소화에 사용될 수.
4. 솔루션을 세척하십시오 : 100 밀리그램 / ML 페니실린, PBS로 100 MG / ML의 스트렙토 마이신을 추가합니다.
5. 기본 미디어를 만들기 : 이글의 매체의 알파 수정은 (α-가상) 10 % FBS 및 100 단위 / ML 페니실린, 100 MG / ML 스트렙토 마이신과 보충.
6. 10% FBS, 100 μM L-아스코르브 산 2 - 인산염, 2 MM L-글루타민, 100 단위 / ML 페니실린, 100 MG / ML로 보충 이글 배지 (α-가상)의 알파 수정 : 확산 미디어 (PM)를 확인 스트렙토 마이신, 0.25 MG / ML amphotericin B.
7. Odontogenic 미디어를 만들기 : 이글의 매체의 알파 수정은 (α-가상) 10 % FBS, 100 μM L-아스코르브 산 2 - 인산염, 2 MM L-글루타민, 100 단위 / ML 페니실린, 100 MG / ML의 스트렙토 마이신, 0.01 μM로 보충 Dexamethasone, 5 MM β-글리세롤 인산 1.8 밀리미터 Monopotassium 인산.

2. 치과 펄프 줄기 세포 Isolatio에 대한 인간 치과 펄프 조직을 준비N

1. 일반 인간의 셋째 어금니가 승인 기관 검토위원회 (IRB)에서 이맘 알리의 치과 클리닉의 성인 (세 21-29년)에서 수집되었다.
2. 치아는 기본 매체 (α-가상 10 % FBS와 보충)에 배치 된, 4 ° C.에서 실험실로 이송되었다
3. 무균 상태에서 생물학적 층류 후드 내에서 작업, 세트 업을 처리 할 수​​ 있도록 각 치아에 대해 하나의 100mm 배양 접시를 완료했다. 치아 표면은 70 % 에탄올에 의해 청소했다.
4. 페트리 - 요리 중 하나에서 작업하는 동안, 치아는 치아 포셉 보관되었으며, 메스 블레이드는 파편과 뿌리에 치주 인대를 닦아하는 데 사용되었다.
5. Cemento - 에나멜 접합은 천천히 펄프 챔버을 나타 내기 위해 살균 치과 디스크를 사용하여 절단되었습니다. 이것은 절단 과정은 치과 조직의 과열 줄이기 위해 천천히 수행해야하는 것으로 간주합니다.
6. 펄프 조직은 부드럽게 왕관과 루트에서 분리되었다.
7. 펄프 조직은 메스 블레이드의 도움으로 작은 조각으로 절단되었다.

3. 인간 치과 펄프 절연

1. 펄프 조직은 hDPSCs의 절연을위한 펄프 조직 explants에서 펄프 조직 또는 직접 휴대 가지 중 하나 효소 분해를 받았습니다.
2. 펄프 조직의 효소 분해 :
   1. 펄프 조직의 작은 조각이 37 ° C.에 1 시간을위한 효소 솔루션으로 이동되었습니다 조직을 파괴하는 데 도움이 소용돌이 매 30 분.
   2. 그 후 70 μM 셀 스트레이너를 통해 세포를 통과하여 큰 셀을 합산이 삭제되었습니다 및 단일 세포 현탁액을 얻었다.
   3. 단일 셀 중지는 상온에서 5 분에 1,200 rpm으로 centrifuged했다.
   4. Supernatants 신중하게 해제 pipetted되었고 펠릿은 1 ML 확산 중간 (PM)에 다시 중지되었습니다. (참고 : 확산 매체에 FBS를 종료 깔 효소sociation.)
   5. 치과 펄프의 단일 셀 중지는 PM과 25cm ^두 문화 플라스크에 놓는 후 5 % CO _2에서 37 ° C에서 incubated되었습니다.
   6. 셀 confluency가 달성 될 때까지 문화 매체는 매 3 일마다 교체되었습니다.
3. 펄프 조직 explants에서 직접 세포 가지 :
   1. 펄프 조직이 1-2-mm 조각으로 다진되었고, 각 조각은 PM 25-cm ² 문화 플라스크에 배치 된 후 37 incubated ° C 5 % CO _2인치 그것은 세포의 가지에 대한 PM의 총 양이 더 셀 가지에 대한 펄프 조각 (플라스크 당 2 ~ 3 개의 ML)의 첨부 파일을 지원해야 고려되어야한다.
   2. 가지가 관찰 된 후 보통이 변경되었습니다.
   3. 합류에 능가 셀 1시 4분의 비율 (통로 1)의 하위 양식이었다.

4. Immunophenotyping

1. / 250000 셀통로 3 세포의 두 종류의 튜브는 4 ° C 어두운 곳에서 30 분 동안 PE 또는 isotypes과 FITC-복합 항 인간 항체에 의해 incubated되었습니다. (참고 :. 항체의 농도가 제조 프로토콜에 따라 적용)
2. 부화 시간 후, 100 μl PBS 또는 FACS 희석 솔루션은 각 튜브에 추가되었습니다하고 어두운 장소에서 5 분 동안 1,200 rpm으로 centrifuged.
3. Supernatants이 삭제되었습니다 & 펠릿는 100 μl PBS 또는 어두운 장소에서 FACS 희석에 다시 일시 중지되었습니다.
4. 타겟 표면 마커 (CD 마커)가 BD FACSCalibur에 의해 평가되었다.

5. Mineralized 셀에 DPSCs의 차별화 유도 및은 알리자린 레드 S 분석을 정량화

1. 펄프 조직 explants (DPSC-OG)에서 펄프 조직의 효소 분해 (DPSC-ED라고도 함) 또는 직접 휴대 가지에 의해 획득 된 DPSCs 3 구절에 대한 하위 양식이었다.
2. t 항로 3, 세포는 5000 셀 /도에서 6도 판에 씨앗이되었다.
3. 60 % 합류에 odontogenic 매체는 기존의 PM에 의해 대체되었다. 세 우물은 성장 매체를 추가하여 대조군으로 남아 있었다.
4. 보통 하루에 21까지 삼일마다 변경합니다.
5. 일 21시, 셀 PBS로 세척 한 1 ML / 잘 실온에서 15 분 10 % paraformaldehyde에 의해 수정되었습니다.
6. 그런 다음 paraformaldehyde는 조심스럽게 해제 pipetted되었고 세포는 소주 H ₂ O.으로 3 회 (각 시간 5-10 분)을 씻어되었습니다 (참고 : monolayer을 방해하지 마십시오.)
7. 세척 후, 1 ML / 잘 알리자린 레드 S는 실온에서 20 분에 추가되었습니다.
8. 셀은 추가 알리자린의 붉은 색을 제거 할 deionized H ₂ O 네 번 (부드러운 요동 각 시간 5 분)에 의해 세척되었다.
9. 1 ML / 잘 H ₂ O는 건조에서 세포를 방지하기 위해 추가되었습니다.
10. 플레이트는 시각적 인 기능으로 간주되었다pection 및 / 또는 이미지 수집.
11. 알리자린 레드 S 정량화 분석의 경우, H ₂ O가 흔들리고있는 실온에서 30 분 6 - 잘 접시 및 배양의 각 잘 1 ML 10% 아세트산에 의해 대체되었다.
12. 그런 다음 잘 세포 monolayer / 털 깎는 & 아세트산 및 세포 모두 별도의 1.5 ML 마이크로 원심 분리기 튜브로 전송 있었다. (참고 :. 각도 각 ED & OG 그룹에 대한 별도의 튜브 즉 세 테스트 우물 및 세 제어 우물에 전송해야합니다)
13. 튜브는 30 초에 힘차게 vortexed했다.
14. 85 열 ° C 10 분에. (참고 : 증발을 방지하기 위해 튜브는 parafilm으로 밀봉되었다.)
15. 난방 후, 튜브는 5 분에 얼음으로 전송되었습니다. (참고 : 냉각 될 때까지 튜브를 열 수 없습니다.)
16. 슬러리는 15 분에 20,000 XG에서 centrifuged했다. centrifuging 있지만, 알리자린 레드 표준은 만들어졌다까지.

알리자린 레드 S 표준은 먼저 희석 버퍼를 diluting 및 테이블을 기반으로 2 배 시리얼 dilutions을 사용하여 준비 하였다.

염료의 높은 범위 농도

염료의 낮은 범위 농도

이 MM

1 ㎜

500 μM

250 μM

125 μM

62.5 μM

31.3 μM

15.6 μM

7.8 μM

3.9 μM

1.9 μM

0.9 μM

0.4 μM

공백

16. 원심 분리 한 후, 표면에 뜨는 / 튜브의 한 ML은 새로운 별도의 1.5 ML 마이크로 원심 분리기 튜브로 전송되었습니다.
17. 산도는 ~ 375 μl 10을 무력화되었다튜브 당 %의 암모니아 수산화. (참고 : pH의 분노 4.1-4.5해야합니다.)
18. 표준 및 샘플 (별도 테스트 및 컨트롤을 포함)의 150 μl를 96 - 웰 플레이트 불투명 벽, 투명 하단에 추가되었습니다.
19. 흡광도는 405 nm의에서 읽고 있던 샘플의 OD 값은 추가 분석을 위해 표준 계획과 비교되었다.

결과

1. 효소 분해 (DPSC-ED)에 의해 획득 된 DPSCs는 하루에 10 15,18 (그림 1)에서 여기에 표시됩니다. 분리 한 후 거의 3-5일에 형성 시작 식민지가.
2. 능가 DPSCs (DPSC-OG)는 5 일, 10, 13 & 18 일 그림 2에 표시됩니다. 세포가 병렬 심는 후 약 5 일까지 주문에 의해 펄프 조직에서 병으로 마이그레이션하기 시작 섬유 아세포과 같은.
3. 두 방법을 사용하여 통로 3 DPSCs은 그림 3에 표시됩니...

토론

이 프로토콜은 두 가지 방법, 효소 분해 및 펄프 조직 explants에서 줄기 세포를 직접 가지를 사용하여 치과 펄프에서 hDPSCs의 절연 및 특성화 과정을 설명합니다. 또한, odontoblasts에 이러한 세포의 체외 차별화에 정량 알리자린 레드 S 검정 & QPCR에 의해 평가되었다.

인간의 치아에서 펄프 조직을 분리에 대한 기존 프로토콜은 이러한 플라이어 (뼈 포셉) 9 근절 바늘 ^2...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 또는 로트. 수	코멘트 (선택 사항)
α-가상	GIBCO	11900-073
Collagenase 유형 I	시그마 - 알드리치	C0130-100MG
Dispase	GIBCO	17105-041
페니실린 / 스트렙토 마이신	GIBCO	15140-122
Amphotericin B	GIBCO	15290-018
태아 소 혈청 정의 (FBS)	HyClone	SH30070.03
2 인산 L-아스코르브 산	시그마	A8960-5G
L-글루타민	GIBCO	25030-024
Dexamethasone	시그마	D4902
β-글리세롤 인산 나트륨 소금 하이드레이트, BioUltra	시그마	G9422-100G
인산 칼륨 일 염기의	시그마 - 알드리치	P5655
Osteogenesis 분석 키트	Millipore	PS01802031
마우스 IgG2b-PE isotype 제어	BD pharmingen	50808088029
FITC 마우스 IgG2b isotype 제어	BD pharmingen	559532
FITC 마우스 IgG1 κ isotype	BD pharmingen	11471471
FITC / PE 마우스 안티 - 인간 CD34/CD45	BD pharmingen	341071
PE 안티 - 인간 CD146	BD pharmingen	550315
단클론 마우스 반 인간 CD90/FITC	Daka	00034418
PE 마우스 반 인간 CD73	BD pharmingen	550257
안티-H CD105/Endoglin PE	BD pharmingen	FAB10971P
PE 마우스 반 인간 CD11b/Mac1	BD pharmingen	5553888
CD44 PE 마우스 반 인간	BD pharmingen	555479
인산염 완충 용액 (PBS)	GIBCO	003000
70 μm 세포 스트레이너	매	352360
0.2 μm 주사기 필터	Millex-GV	SLGV033RB
25cm 두 문화 플라스크	시그마 - 알드리치	Z707481
			장비
BD FACSCalibur	BD	342975
multiskan microplate 분광 광도계	열 과학	51119200
Fleurcense 현미경	하늘
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