İnsan Diş Pulp Kök Hücre İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Karşılaştırmalı Farklılaşma İki Farklı Yöntemler Kullanılarak Daimi Dişler türetilen

Özet

Yöntemi kullanarak insan dental pulpa kök hücrelerinin (hDPSCs) izolasyonu ve karakterizasyonu tarif enzimatik ayrışma (DPSC-ED) Veya direkt sonucudur (DPSC-OG). Sonra takip In vitro karşılaştırmalı farklılaşma.

Özet

Giriş

Kök hücreler, çok kudret ve kendini yenileme ¹⁵ olarak bilinen iki önemli özellik, sahip clonogenic hücrelerdir. Farklı replikatif potenslerine Tüm kök hücreler arasında, postnatal kök hücreler olarak diş kök hücreleri nedeniyle erişilebilirlik, esneklik, ve diğer yetişkin kök hücreleri ¹⁶ ile karşılaştırıldığında yüksek proliferatif yeteneği son yıllarda dikkat çekmektedir. Karakteristik olarak, mezenkimal kök hücreler ile benzer şekilde, diş özü kök hücrelerinin farklılaşmasını çoklu mezenşim içine kapasitesi ve / veya in vitro ve in vivo hem de non-mezenşim soy sahip yapışık clonogenic hücrelerdir. ^1-8,17,18 DPSCs ile tanımlanır olumsuz hematopoetik antijenlerin ekspresyonu (örneğin, CD45, CD34, CD14) ve CD90 pozitif ifadesi, CD29, CD73, CD105, CD44 ve STRO-1. ^19,20

Minimum ağrı ve morbidite ile kolay elde potansiyeli valu olarak insan DPSCs yapmakMKH yapabiliyor kaynağı kemik iliği mezenkimal kök hücre ²¹ olarak sıradan kaynaklarına kıyasla. Genel olarak, DPSCs ya akıbet yöntemi, yani, pulpa dokusu eksplantlar (DPSC-OG) ^22-24, ve / veya enzimatik sindirim (DPSC-ED) ^4,6,25 kök hücrelerin göç ile izole edilmiştir. Önceki çalışmalar izolasyon yöntemi ve kültür koşullarında in vitro pasajlar ^26,27 bölgesindeki altında farklı popülasyonlarda veya soy neden olduğunu göstermiştir. Kalıcı dişlerin (pDPSCs) söz konusu olduğunda, Huang ve ark enzimatik sindirimi pDPSCs geçmek DPSCs kıyasla daha yüksek çoğalma potansiyeli olduğunu ortaya koymuştur. Ayrıca ^26, dişlerin (dDPSCs) söz konusu olduğunda, bu gösterilmiştir ki STRO-1 ve CD34 belirteçleri dDPSC-OG ile karşılaştırıldığında dDPSC-ED daha dile getirdi. Buna ek olarak, dDPSC-ED tanımlanan osteo / odonto ortam içinde daha yüksek bir mineralizasyon hızı görüntülenir. Bu nedenle ²⁷ sebebiyle r DPSCs olağanüstü potansiyeliegenerative tıp, daha fazla çalışmaları farklı izolasyon yöntemleri türetilmiştir olası çeşitli popülasyonlarda daha iyi anlaşılması için gerekli olacaktır.

İşte, bu hamuru çıkarma sürecini kolaylaştırmak için bir adım diş elmas disketini kullanarak, hamuru ekstraksiyon kolay bir şekilde tanıtmak için bir girişimdi. Ayrıca ED veya OG yöntemleri uygulayarak insan pulpa kaynaklı kök hücrelerin izolasyonu sonra, iki grup arasında genel özellikleri ve farklılaşma kapasitesi de incelenmiştir.

Protokol

1. Enzim Çözüm ve Çoğalma Orta (PM) hazırlayın

1. Kollajenaz Tip I olun Çözüm: kollajenaz tip I (12 mg / ml) tartılır ve bir 0.2 mikron şırınga filtresi kullanarak 1 ml PBS ve filtre içinde çözülür. Sonra 15 ml tüp yerleştirin ve gerektiği kadar -20 ° C'de saklayın.
2. Çözelti dispase edin: dispase tartılır (16 mg / ml) ve 1 ml PBS ve filtre bir 0.2 um şırınga filtresi kullanılarak çözülür. Sonra 15 ml tüp yerleştirmek ve gerektiğinde ° C ye kadar 4 başında tutmak.
3. Enzim çözeltisi edin: 2 ml steril PBS 100 mg / ml penisilin, 100 mg / ml streptomisin içeren içine 1 ml kollajenaz tip bir eriyik (12 mg / ml) ve 1 ml dispase çözeltileri (16 mg / ml) ilave edilir. Nihai hacim içinde dispase ve kollajenaz bir toplam konsantrasyon receptively 4 mg / ml ve 3 mg / ml olmalıdır. Sonra, dört 15 ml tüp, her birinde 1 ml enzim çözeltisi için kısım bu hacim. Her bir tüp, bir kağıt hamuru sindirim için kullanılabilecek.
4. Yıkama çözeltisi edin: 100 mg / ml penisilin, PBS içinde 100 mg / ml streptomisin ekleyin.
5. Temel ortam edin: Eagle ortamı alfa modifikasyonu (α-MEM)% 10 FBS ve 100 birim / ml penisilin, 100 mg / ml streptomisin ile desteklenmiş.
6. % 10 FBS, 100 uM L-askorbik asit 2-fosfat, 2 mM L-glutamin, 100 birim / ml penisilin, 100 mg / ml ile desteklenmiş Eagle ortamı (α-MEM) 'in alfa modifikasyonu: Proliferasyon Ortam (PM) yapmak streptomisin ve 0.25 mg / ml amfoterisin B
7. Odontojenik medya edin: Eagle ortamı alfa modifikasyonu (α-MEM)% 10 FBS, 100 uM L-askorbik asit 2-fosfat, 2 mM L-glutamin, 100 birim / ml penisilin, 100 mg / ml streptomisin, 0.01 uM ile desteklenmiş Deksametazon, 5 mM β-gliserol fosfat, 1.8 mM Monopotasyum fosfat.

2. Diş Pulp Kök Hücre Isolatio İnsan Dental Pulpa Dokusu hazırlayınn

1. Normal insan üçüncü molar diş onaylı Kurumsal İnceleme Kurulu (KİK) kapsamında İmam Ali'nin Diş Kliniği'nde yetişkin (yaş 21-29 yıl) toplanmıştır.
2. Dişler temel ortam (MEM α-% 10 FBS ile takviye edilmiş) içine yerleştirildi ve 4 ° C de laboratuvar aktarıldı
3. Steril şartlarda, bir biyolojik tehlike laminer akış kaputu içinde çalışan, set-up işlenecek her diş için bir 100 mm Petri kapları yapıldı. Diş yüzeyleri% 70 etanol ile temizlendi.
4. Petri-yemekleri birinde çalışırken, diş diş forseps ile tutuldu ve Bistüri enkaz ve kökleri üzerinde periodontal ligament kapalı temizlemek için kullanılmıştır.
5. Mine-sement yavaş hamuru oda ortaya çıkarmak için sterilize diş disk kullanılarak kesildi. Bu kesme prosesi diş dokusu aşırı yavaş yavaş azaltmak için yapılması gereken olduğu göz önünde bulundurulmalıdır.
6. Pulp doku hafifçe taç ve kök ayrıldı.
7. Pulp doku bir neşter bıçak yardımı ile küçük parçalar halinde kesilmiş.

3. İnsan Diş Selüloz İzolasyon

1. Pulp dokuların hDPSCs izolasyonu için pulpa dokusu eksplantlarından pulpa dokusu veya doğrudan hücre akıbet birini enzimatik ayrışma uygulandı.
2. Pulpa dokusunun Enzimatik ayrışma:
   1. Kağıt hamuru dokuların küçük parçaları 37 ° C sıcaklıkta 1 saat için enzim solüsyonu içine aktarıldı Doku kesiliyor yardım Vorteks her 30 dk.
   2. Daha sonra, bir 70 uM hücre süzgecinden hücreleri geçirilerek büyük hücre agregatları çıkarıldı ve tek hücre süspansiyonları elde edildi.
   3. Tek hücre süspansiyonları oda sıcaklığında 5 dakika için 1200 rpm'de santrifüjlenmiştir.
   4. Süpernatantlar dikkatle kapalı pipetle alındı ​​ve pelet 1 ml çoğalması orta (PM) yeniden askıya alınmıştı. (Not: yayılması orta FBS sonlandırmak dis enzimatiksociation.)
   5. Diş hamuru Tek hücre süspansiyonları PM ile 25 cm ² kültürü şişesi içine ekilmiş ve daha _sonra% 5 CO2 içinde 37 ° C de inkübe edildi.
   6. Hücre konfluense elde edilene kadar kültür ortamı her üç günde bir değiştirildi.
3. Pulpa dokusu eksplantlarından Doğrudan hücre akıbet:
   1. Selüloz doku 1-2 mm'lik parçalara kıyılmış edildi ve her bir parça PM ile 25 cm ² kültür kaplarına yerleştirilir ve daha sonra 37 ° C'de _inkübe% 5 CO2 içinde. Bu hücre akıbet için PM toplam hacmi daha fazla hücre akıbet için hamuru parçaları (şişesi başına 2-3 ml) eki desteklemesi gerektiğini dikkate alınmalıdır.
   2. Filiz gözlenmiştir sonra ortam değiştirilmiştir.
   3. Izdiham geçmek hücreleri 1:4 oranı (geçit 1) alt-kültür vardı.

4. Immünofeotipleme

1. / 250,000 hücrelerpasaj 3'de hücrelerinin her iki türdeki boru 4 ° C karanlık bir yerde, 30 dakika için PE ya da izotipleri ile FITC-konjüge anti-insan antikor ile enkübe edildi. (Not:. Antikorların konsantrasyonu üretimi protokolüne uygun olarak uygulanmıştır)
2. İnkübasyon süresinden sonra, 100 ul PBS ya da FACS seyreltme çözeltisi her bir tüpe eklendi ve karanlık bir yerde, 5 dakika için 1200 rpm'de santrifüjlenmiştir.
3. Süpernatantlar çıkarıldı ve granül 100 ul PBS veya karanlık bir yerde FACS seyreltme yeniden askıya alındı.
4. Hedefli yüzey belirteçleri (CD marker) BD FACSCalibur tarafından değerlendirildi.

5. Mineralize Hücre içine DPSCs Farklılaşma İndüksiyon & Alizarin Red S Assay Sayısallaştırılmış

1. Pulpa dokusu eksplantları (DPSC-OG) gelen pulpa dokusunun enzimatik ayrışma (DPSC-ED olarak da bilinir) veya doğrudan hücre akıbet biri tarafından alındı ​​DPSCs 3 geçişleri için alt-kültür vardı.
2. At Passage 3, hücre 5.000 hücre / kuyu başında 6 plaka içine tohum edildi.
3. % 60 izdiham, odontojenik orta konvansiyonel PM değiştirilmiştir. Üç kuyu büyüme ortamı ilave edilerek bir negatif kontrol olarak kaldı.
4. Orta günde 21 kadar 3 gün boyunca her değiştirin.
5. 21. günde, hücreler PBS ile yıkandı ve 1 ml / kuyucuk oda sıcaklığında 15 dakika için% 10 paraformaldehit ile fikse edildi.
6. Daha sonra paraformaldehid dikkatli bir şekilde, kapalı pipetlendi ve hücreler damıtık H ₂ O ile 3 kez (her zaman için 5-10 dk) yıkandı (Not: tek tabaka rahatsız kaçının.)
7. Yıkandıktan sonra, 1 ml / Alizarin kırmızı S oda sıcaklığında 20 dakika boyunca ilave edildi.
8. Hücreler herhangi bir ek Alizarin kırmızı uzaklaştırmak için deiyonize _H2O dört kez (nazik sallama ile, her seferinde 5 dakika) ile yıkandı.
9. 1 ml / _H2O kurumasını engellemek için hücrelerin ilave edildi.
10. Plakaları görsel ins kabul edildipection ve / veya görüntü alma.
11. Alizarin Kırmızı S miktar tayini için, _H2O sallama ile oda sıcaklığında 30 dakika için 6 plaka ve inkübe her bir kuyucuğa 1 ml% 10 asetik asit ile değiştirilmiştir.
12. Sonra, iyi hücre monolayer / kazıma ve asetik asit ve hücreler iki ayrı 1.5 ml mikro-santrifüj tüplerine aktarıldı vardı. (Not:. Her iyi her ED ve RG grupları için ayrı bir tüp yani üç test kuyuları ve üç kontrol kuyulara transferi olmalıdır)
13. Tüpler 30 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde vortekslenmiş edildi.
14. 85 ° C ısı 10 dakika için. (Not: buharlaşma önlemek için, tüpleri parafilm ile imzalandı.)
15. Isıtmadan sonra, tüp 5 dakika için buz içine transfer edildi. (Not: soğutmalı hale gelene kadar Tüpler açılmamalıdır.)
16. Bulamaçları 15 dakika için 20,000 x g'de santrifüjlenmiştir. Santrifüj iken, Alizarin Kırmızı standartları yapılmıştırkadar.

Alizarin Kırmızı S standart ilk seyreltme tamponu seyreltilmesi ve tablosuna göre 2-kat seri seyreltiler yapmak için kullanılan ile hazırlanmıştır.

Boya Yüksek Oranda konsantrasyonu

Boya Düşük Aralığı konsantrasyonu

2 mM

1 mM

500 uM

250 uM

125 mcM

62.5 uM

31.3 uM

15.6 uM

7.8 uM

3.9 uM

1.9 uM

0.9 uM

0.4 uM

Boş

16. Santrifüj sonra süpernatant / tüp 1 ml yeni ayrı 1.5 ml mikro-santrifüj tüplerine aktarıldı.
17. PH ~ 375 ul 10 ile nötralize edildi;Tüp başına% amonyum hidroksit. (Not: öfke pH 4.1-4.5 olmalıdır.)
18. Standart ve numune (ayrı testler ve kontroller dahil) 150 ul 96-plaka opak-duvarlı, şeffaf alt içine ilave edildi.
19. Absorbansı 405 nm'de okunmuştur ve örnekleri OD değerleri, daha fazla analiz için standart arsa ile karşılaştırılmıştır.

Sonuçlar

1. Enzimatik ayrışma (DPSC-ED) ile elde edildi DPSCs günde 10, 15,18 (Şekil 1) burada gösterilir. Dışlanmasının ardından yaklaşık 3 ila 5 gün oluşmaya başlayan koloniler.
2. Geçmek DPSCs (DPSC-OG) günlük 5, 10, 13 ve 18, Şekil 2'de gösterilmiştir. Hücreleri paralel tohumlama sonra yaklaşık 5 gün tarafından sipariş ederek hamuru doku balonun içine göç etmeye başladılar Fibroblast benzeri.
3. Her iki yöntem kullanılarak pasaj 3'de DPSCs Şekil ...

Tartışmalar

Bu protokol iki yöntem, enzimatik ayrışma ve pulpa dokusu eksplantlar alınan kök hücrelerin direkt sonucudur kullanarak diş hamurundan hDPSCs izolasyonu ve karakterizasyonu süreci anlatılmaktadır. Buna ek olarak, odontoblastlar bu hücrelerin in vitro olarak farklılaşma, kantitatif Alizarin Kırmızı S tahlil ve QPCR ile değerlendirildi.

İnsan dişinden pulpa dokusu izole etmek için mevcut protokoller pense (kemik forseps) 9, imha iğne ^29, Gracey küret <...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog veya Lot. numara	Yorumlar (isteğe bağlı)
α-MEM	GIBCO	11900-073
Kollajenaz tip I	Sigma-Aldrich	C0130-100mg
Dispase	GIBCO	17105-041
Penisilin / streptomisin	GIBCO	15140-122
Amfoterisin B	GIBCO	15290-018
Fetal Bovine Serum tanımlı (FBS)	HyClone	SH30070.03
2-fosfat L-askorbik asit	Sigma	A8960-5G
L-glutamin	GIBCO	25030-024
Deksametazon	Sigma	D4902
β-gliserol fosfat disodyum tuzu hidrat, BioUltra	Sigma	G9422-100G
Potasyum fosfat tekbazlı	Sigma-Aldrich	P5655
Osteogenezis Assay Kit	Millipore	PS01802031
Fare IgG2b-PE izotip kontrol	BD Pharmingen	50808088029
FITC fare IgG2b izotip kontrol	BD Pharmingen	559532
FITC fare IgG1 κ izotip	BD Pharmingen	11471471
FITC / PE fare anti-insan CD34/CD45	BD Pharmingen	341071
PE anti-insan CD146	BD Pharmingen	550315
Monoklonal fare anti-insan CD90/FITC	Daka	00034418
PE fare anti-insan CD73	BD Pharmingen	550257
Anti-h CD105/Endoglin PE	BD Pharmingen	FAB10971P
PE fare anti-insan CD11b/Mac1	BD Pharmingen	5553888
CD44 PE fare anti insan	BD Pharmingen	555479
Fosfat tampon çözeltisi (PBS)	GIBCO	003000
70 mikron hücre süzgecinden	Şahin	352360
0.2 um şırınga filtresinden	Millex-GV	SLGV033RB
25 cm 2 kültürü şişesi	Sigma-Aldrich	Z707481
			EKİPMAN
BD FACSCalibur	BD	342975
Multiskan mikroplak spektrofotometre	Termo bilimsel	51119200
Fleurcense Mikroskop	Olimpos
Yazılım sürümü 2.3.1 Flowing