Isolamento, caracterização e comparativa Diferenciação de células-tronco da polpa dentária Derivado de dentes permanentes usando dois métodos diferentes

Resumo

O método descrito o isolamento e caracterização de células pulpares humanas estaminais (hDPSCs) usando Dissociação enzimática da celulose (DPSC-ED) Ou Conseqüência direta de células-tronco a partir de explantes de tecido de celulose (DPSC-GO). Seguido por In vitro Diferenciação comparativa dos dois tipos de hDPSCs em odontoblastos.

Resumo

Introdução

As células-tronco são células que possuem clonogénicos duas características marcantes, conhecidos como multi-potência e auto-renovação ^15. Entre todas as células estaminais com potências diferentes replicativas, as células estaminais dentários como as células-tronco pós-natais têm chamado a atenção nos últimos anos por causa da sua acessibilidade, plasticidade e capacidade proliferativa elevada em comparação com as células estaminais adultas outros ^16. Caracteristicamente, semelhante para as células estaminais mesenquimais, as células estaminais da polpa dentária são células aderentes clonogénicas que têm a capacidade de diferenciação em múltiplas mesênquima e / ou não-mesênquima linhagens, tanto in vitro como in vivo. ^1-8,17,18 DPSCs são identificados pela a sua expressão negativa de antigénios hematopoiéticas (por exemplo, CD45, CD34, CD14), e da expressão de CD90 positivas, CD29, CD73, CD105, CD44 e STRO-1, ^19,20.

Potencial obtida fácil com o mínimo de dor e morbidade fazer DPSCs humanos como um valiosofonte capaz de MSCs em comparação com as fontes comuns, tais como a da medula óssea as células estaminais mesenquimais ^21. Em geral, DPSCs ter sido isolada por qualquer método outgrowth, isto é, a migração de células estaminais a partir de explantes de tecido de celulose (DPSC-OG) ^22-24, e / ou por digestão enzimática (DPSC-ED) ^4,6,25. Estudos anteriores têm mostrado que o método de isolamento e as condições de cultura podem induzir diferentes populações ou linhagens sob passagens in vitro ^26,27. No caso dos dentes permanentes (pDPSCs), Huang et al mostraram que enzimáticas pDPSCs digeridos têm um maior potencial de proliferação em comparação com os DPSCs crescido. ^{26 Por outro lado,} no caso dos dentes de leite (dDPSCs), demonstrou-se que STRO-1 e CD34 marcadores expressa mais em dDPSC-ED em comparação com dDPSC-OG. Além disso, dDPSC-ED apresentado maior taxa de mineralização em meio definido osteo / odonto. ²⁷ Portanto, devido ao excelente potencial de DPSCs em regenerative medicina, mais estudos serão necessários para uma melhor compreensão das possíveis várias populações que são derivadas de diferentes métodos de isolamento.

Aqui, ela foi a tentativa de introduzir de maneira fácil a extracção da polpa, utilizando-se um passo de disco de diamante dental para facilitar o processo de extracção da polpa. Além disso, após o isolamento de células-tronco derivadas de celulose, aplicando métodos de ED ou OG, propriedades gerais e capacidade de diferenciação entre os dois grupos também foram investigados.

Protocolo

1. Prepare a solução de enzima e meio de proliferação (PM)

1. Fazer colagenase tipo I Solução: Pesar colagenase tipo I (12 mg / ml) e dissolver em 1 ml de PBS e de filtro usando um filtro de seringa de 0,2 | im. Em seguida, colocá-lo 15 ml de tubo e mantê-lo a -20 ° C até ser necessário.
2. Solução fazer dispase: Pesar dispase (16 mg / ml) e dissolver em 1 ml de PBS e de filtro usando um filtro de seringa de 0,2 | im. Em seguida, colocá-lo 15 ml de tubo e manter a 4 ° C até ser necessário.
3. Fazer a solução de enzima: Adicione 1 ml de colagenase tipo I de soluções (12 mg / ml) e 1 ml de soluções de dispase (16 mg / ml) na 2 ml de PBS estéril, contendo 100 mg / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina. Concentração total de colagenase e dispase I em volume final deve ser de 4 mg / ml e 3 mg / ml, receptivamente. Em seguida, este volume da alíquota para quatro tubos de 15 ml, contendo cada um deles uma solução de enzima ml. Cada tubo podia ser usado para uma digestão de celulose.
4. Fazer a solução de lavagem: Adicionam-se 100 mg / ml de penicilina, 100 mg / mL de estreptomicina em PBS.
5. Fazer meio básico: Alpha modificação do meio de Eagle (α-MEM) suplementado com FBS a 10% e 100 unidades / ml de penicilina, estreptomicina 100 mg / ml.
6. Fazer a mídia Proliferação (PM): Alpha modificação do meio de Eagle (α-MEM) suplementado com FBS a 10%, 100 uM de ácido L-ascórbico-2-fosfato, 2 mM de L-glutamina, 100 unidades / penicilina ml, 100 mg / ml estreptomicina, 0,25 mg / ml de anfotericina B.
7. Fazer media odontogênicos: Alpha modificação do meio de Eagle (α-MEM) suplementado com FBS a 10%, 100 uM de ácido L-ascórbico-2-fosfato, 2 mM de L-glutamina, 100 unidades / penicilina ml, 100 mg / ml de estreptomicina, 0,01 uM dexametasona, 5 mM de fosfato de glicerol β-, 1,8 mM de fosfato monopotássico.

2. Prepare polpa dental humano para Dental Isolatio celular Pulp Stemn

1. Normais terceiros molares humanos foram coletados de adultos (21-29 anos de idade) na Clínica de Odontologia da Imam Ali, sob aprovado Institutional Review Board (IRB).
2. Os dentes foram colocados em meio básico (α-MEM suplementado com FBS 10%) e foram transferidos em laboratório, a 4 ° C.
3. Sob a condição estéril, trabalhando dentro de um capuz de risco biológico de fluxo laminar, set-up foi feita uma placas de 100 mm de Petri para cada dente a ser processado. Superfícies dos dentes foram limpos por etanol 70%.
4. Enquanto trabalha em um dos pratos de Petri-, dente foi mantido por meio de fórceps dentais e uma lâmina de bisturi foi utilizada para limpar os detritos e do ligamento periodontal, nas raízes.
5. Cemento-esmalte junção foi lentamente cortar usando esterilizados disco dental para revelar a câmara pulpar. Deve-se considerar que o processo de corte tem de ser realizada lentamente para reduzir o sobreaquecimento do tecido dental.
6. Tecido pulpar foi gentilmente separada da coroa e raiz.
7. Polpa foi cortada em pequenos pedaços, com o auxílio de uma lâmina de bisturi.

3. Isolamento Pulp humana Dental

1. Tecidos pulpares foi submetido a dissociação enzimática do tecido pulpar ou conseqüência direta de células a partir de explantes de polpa de tecidos para isolamento de hDPSCs.
2. Dissociação enzimática do tecido pulpar:
   1. Pequenos pedaços de tecidos de polpa foram transferidos para solução de enzimas, durante 1 hora a 37 ° C. Vortex cada 30 minutos para ajudar a romper o tecido.
   2. Depois, os agregados celulares grandes foram removidos e as suspensões unicelulares foram obtidos pela passagem de células através de um coador de células de 70 | iM.
   3. Unicelulares suspensões foram centrifugadas a 1200 rpm durante 5 min à temperatura ambiente.
   4. Os sobrenadantes foram cuidadosamente pipetado fora e pelete foi re-suspenso em 1 ml de meio de proliferação (PM). (Nota: FBS em meio de proliferação encerrar enzimática disassociação.)
   5. Unicelulares suspensões de polpa dentária foi semeada em frasco de cultura de 25 cm ² com AM e, em seguida, incubadas a 37 ° C em 5% de CO _2.
   6. O meio de cultura foi mudado de três em três dias até a confluência celular foi alcançada.
3. Conseqüência direta de células a partir de explantes de tecido de celulose:
   1. Polpa foi picada em 1-2 mm de fragmentos, e cada peça foi colocada em 25-cm ² frascos de cultura com PM e, em seguida, incubadas a 37 ° C em 5% de CO _2. Deve-se considerar que o volume total da PM para crescimento de célula deve apoiar a fixação de peças de celulose para crescimento celular ainda (2-3 ml por frasco).
   2. O meio foi mudado após crescimento foi observado.
   3. As células crescido em confluência foram sub-cultivadas a uma razão de 1:4 (passagem 1).

4. Imunofenotipagem

1. 250.000 células /tubo de ambos os tipos de células na passagem 3 foram incubadas por PE ou FITC-conjugado anti-humano com anticorpos com os seus isotipos durante 30 min a 4 ° C num local escuro. (Nota:. Da concentração de anticorpos foi aplicada de acordo com o protocolo de fabricação)
2. Após o tempo de incubação, 100 uL de PBS ou de FACS solução de diluição foi adicionada a cada tubo e centrifugou-se a 1200 rpm durante 5 min, em local escuro.
3. Os sobrenadantes foram removidos e pelotas foram re-suspensas em 100 ul de PBS ou de diluição FACS em local escuro.
4. Marcadores de superfície alvo (marcadores CD) foram avaliados por BD FACSCalibur.

5. A indução da diferenciação de células em DPSCs mineralizadas e quantificada Ensaio Vermelho de alizarina S

1. DPSCs que foram obtidos por um ou outro dissociação enzimática do tecido pulpar (conhecido como DPSC-ED) ou excrescência celular directa a partir de explantes de tecido de celulose (DPSC-OG) foram sub-cultivadas durante 3 passagens.
2. At A passagem 3, as células foram de semente em uma placa de 6 poços a 5000 células / poço.
3. Na confluência de 60%, o meio foi substituído por odontogênico PM convencional. Três cavidades foram permaneceu como um controlo negativo pela adição de meio de crescimento.
4. Médio mudam a cada 3 dias até o dia 21.
5. No dia 21, as células foram lavadas com PBS e foram fixadas em 1 ml / poço de 10% de paraformaldeído durante 15 min à temperatura ambiente.
6. Em seguida, foram pipetados paraformaldeído fora, com cuidado e as células foram lavadas 3 vezes (5-10 min para cada vez) com água destilada H ₂ O. (Nota: Evite perturbar a monocamada.)
7. Após a lavagem, 1 ml / poço de vermelho de alizarina S foram adicionados durante 20 min à temperatura ambiente.
8. As células foram lavadas por desionizada H ₂ O (quatro vezes 5 min de cada vez, com agitação suave), para remover qualquer vermelho de alizarina adicional.
9. 1 ml / poço de H ₂ O foram adicionados para evitar que as células de secagem.
10. As placas foram assumidos como ins visuaispection e / ou aquisição de imagem.
11. Para o ensaio com vermelho de alizarina S quantificação, H ₂ O foram substituídos por 1 ml de ácido acético a 10% a cada poço da placa de 6 poços e incubar durante 30 min à temperatura ambiente com agitação.
12. Então, monocamada de células / poço foram scrape & tanto o ácido acético e as células foram transferidas para as separar de 1,5 ml de centrífuga de micro-tubos. (Nota:. Cada poço deve ser transferido para um tubo separado ou seja, três poços de teste e três poços de controle para cada grupo de ED & OG)
13. Os tubos foram agitados vigorosamente durante 30 sec.
14. Aquece-se a 85 ° C durante 10 min. (Nota: para evitar a evaporação, os tubos foram selados com parafilme.)
15. Após o aquecimento, os tubos foram transferidos para gelo, durante 5 min. (Nota: Os tubos não deve ser aberta até que se esfriou.)
16. As suspensões foram centrifugadas a 20.000 xg durante 15 min. Embora a centrifugação, as normas de vermelho de alizarina foram feitas-se.

Padrão vermelho de alizarina S foram preparadas por diluição da primeira tampão de diluição e usado para fazer duas diluições em série com base na tabela.

Gama Alta concentração de corante

Gama Baixa concentração de corante

2 mM

1 mM

500 uM

250 uM

125 uM

62,5 mM

31,3 mM

15,6 mM

7,8 mM

3,9 mM

1,9 mM

0,9 mM

0,4 uM

Em branco

16. Após a centrifugação, 1 ml de sobrenadante / tubo foram transferidas para novos separados de 1,5 ml de centrífuga de micro-tubos.
17. O pH foi neutralizado com 375 ul ~ 10Hidróxido de amónio% por tubo. (Nota: a raiva pH deve ser 4,1-4,5).
18. 150 ul de padrão e amostras (inclui testes separados e controlos) foram adicionados a um opaco de parede de fundo transparente, de 96 poços da placa.
19. A absorvância foi lida a 405 nm e os valores de OD das amostras foram comparadas com o lote padrão para análise posterior.

Resultados

1. DPSCs que foram obtidos por dissociação enzimática (DPSC-ED) são mostrados aqui no dia 10, 15,18 (Figura 1). As colónias iniciadas de modo a formar em quase 3 a 5 dias após o isolamento.
2. DPSCs outgrown (DPSC-OG) são mostrados na Figura 2, no dia 5, 10, 13 & 18. Fibroblast-como as células começaram a migrar a partir do tecido da polpa para o balão através paralelo ordenação por cerca de 5 dias após a semeadura.
3. DPSCs a passagem 3, utilizando os dois métodos...

Discussão

Este protocolo descreve o processo de isolamento e caracterização de hDPSCs da polpa dentária através de dois métodos, dissociação enzimática e excrescência directa de células estaminais a partir de explantes de tecido de celulose. Além disso, a diferenciação in vitro destas células em odontoblastos, foi avaliada por ensaio quantitativo Vermelho de alizarina S & QPCR.

Os protocolos existentes para o isolamento de tecido de polpa de dentes humanos foram uti...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Catálogo ou Lot. número	Comentários (opcional)
α-MEM	GIBCO	11900-073
Colagenase tipo I	Sigma-Aldrich	C0130-100mg
Dispase	GIBCO	17105-041
Penicilina / estreptomicina	GIBCO	15140-122
A anfotericina B	GIBCO	15290-018
Soro de bovino fetal definido (FBS)	HyClone	SH30070.03
Ácido L-ascórbico 2-fosfato	Sigma	A8960-5G
L-glutamina	GIBCO	25030-024
Dexametasona	Sigma	D4902
β glicerol-fosfato de hidrato de sal de dissódio, BioUltra	Sigma	G9422-100G
Fosfato de potássio monobásico	Sigma-Aldrich	P5655
Osteogênese Ensaio Kit	Millipore	PS01802031
Rato IgG2b-PE isotipo controle	BD Pharmingen	50808088029
FITC rato IgG2b isotipo controle	BD Pharmingen	559532
FITC rato IgG1 κ isotipo	BD Pharmingen	11471471
FITC / PE de murganho anti-humano CD34/CD45	BD Pharmingen	341071
PE CD146 anti-humano	BD Pharmingen	550315
Anticorpo monoclonal de rato anti-humano CD90/FITC	Daka	00034418
PE rato anti-CD73 humano	BD Pharmingen	550257
Anti-h CD105/Endoglin PE	BD Pharmingen	FAB10971P
PE rato CD11b/Mac1 anti-humano	BD Pharmingen	5553888
CD44 PE rato anti humano	BD Pharmingen	555479
Solução tampão de fosfato (PBS)	GIBCO	003000
70 mícrons coador celular	Falcão	352360
0,2 um filtro de seringa	Millex-GV	SLGV033RB
25 centímetros frasco de cultura de 2	Sigma-Aldrich	Z707481
			EQUIPAMENTOS
BD FACSCalibur	BD	342975
multiskan microplaca espectrofotômetro	Thermo Scientific	51119200
Microscópio Fleurcense	Olimpo
Fluindo versão de software 2.3.1