Prosencéfalo electrofisiológico de grabación en larvas de pez cebra

Resumen

Un método simple para registrar los potenciales de campo extracelular en el cerebro anterior de las larvas de pez cebra se describe. El método proporciona una robusta In vivo Lectura de actividades similares a convulsiones. Esta técnica se puede utilizar con larvas de pez cebra transgénico que lleva genes relacionados con la epilepsia o las convulsiones provocadas por la administración de fármacos anticonvulsivos.

Resumen

La epilepsia afecta a casi 3 millones de personas en los Estados Unidos y hasta 50 millones de personas en todo el mundo. Se define como la aparición de convulsiones no provocadas espontáneos, la epilepsia puede ser adquirido como resultado de un daño cerebral o una mutación genética. Los esfuerzos para convulsiones modelo en animales han utilizado principalmente adquirido insultos (fármacos anticonvulsivos, estimulación o lesión cerebral) y las manipulaciones genéticas (knockdown antisentido, la recombinación homóloga o transgénesis) en roedores. El pez cebra son un sistema modelo vertebrado ^1-3 que podría proporcionar una valiosa alternativa a los roedores investigación basada en la epilepsia. El pez cebra se utilizan extensivamente en el estudio de la genética de vertebrados o de desarrollo, presentan un alto grado de similitud genética para los mamíferos y expresar homólogos de ~ 85% de las mutaciones conocidas humanos epilepsia de un solo gen. Debido a su pequeño tamaño (4-6 mm de largo), larvas de pez cebra puede ser mantenido en volúmenes de fluido tan bajo como 100 l durante el desarrollo temprano y arraYED en múltiples pocillos. Los reactivos se pueden añadir directamente a la solución en la que se desarrollan los embriones, la simplificación de la administración del fármaco y que permite una rápida selección in vivo de compuestos de ensayo ^4. Los oligonucleótidos sintéticos (morfolinos), mutagénesis, dedo de zinc nucleasa y enfoques transgénicos se pueden utilizar para generar rápidamente desmontables gen o mutación en el pez cebra ^5-7. Estas propiedades costear los estudios de pez cebra sin precedentes ventaja estadística sobre el análisis del poder roedores en el estudio de los trastornos neurológicos como la epilepsia. Debido a que el "estándar de oro" para la investigación epilepsia es monitorear y analizar las descargas eléctricas anormales que se originan en una estructura del cerebro central (por ejemplo, convulsiones), un método para grabar de manera eficiente la actividad cerebral en larvas de pez cebra se describe aquí. Este método es una adaptación de las técnicas convencionales de registro extracelular y permite una estabilidad a largo plazo de vigilancia de la actividad cerebral en larvas de pez cebra intacto. Sgrabaciones amplias se muestran para las convulsiones agudas inducidas por la aplicación de fármacos anticonvulsivos baño y convulsiones espontáneas grabadas en un pez modificado genéticamente.

Protocolo

1. Huevo de Producción y Recolección

1. El pez cebra cría sigue los procedimientos estándar descritos previamente ^8. En pocas palabras, el pez cebra adultos se instalan en acuarios de cría con separadores en su lugar. Cuando las luces de la habitación se enciende a la mañana siguiente, los divisores son retirados de los tanques de cría y los peces se permiten aproximadamente 20 a 60 minutos de tiempo de apareamiento sin ser molestados.
2. Los huevos procedentes de tanques de cría se recogen en un filtro y se enjuagó con agua huevo. Los huevos se transfieren entonces a una placa de Petri con agua huevo. Huevos no fertilizados y desechos se eliminan utilizando una pipeta de transferencia.
3. Coloque una placa de Petri que contiene los huevos recolectados en una incubadora (28-32 ° C). Después de incubar huevos, unos dos días después de la fertilización (dpf), retire cualquier residuo corion y otro con una pipeta de transferencia.
4. En el día deseado después de la fertilización (3 a 8 dpf) eliminar placa de Petri que contiene las larvas libremente natación y el lugar en el banco de laboratorio a temperatura ambiente.

2. Tirando de microelectrodos y Preparación

1. El uso de un extractor de micropipeta, tire de 1,2 mm de diámetro externo de borosilicato de vidrio capilar en dos agujas y guárdelos en un plato de Petri de 150 mm o caja pipeta vacía por encima de las rampas de plastilina. Las agujas pueden ser tirado por adelantado. Diferente OD capilares de vidrio se pueden utilizar dependiendo del tipo de headstage amplificador disponible.
2. Retrocarga el microelectrodo con solución de registro extracelular (2 M NaCl) utilizando una jeringa de 1 ml con un filtro de jeringa Nalgene (4-mm) y Microfil filamento (Warner Precision Instruments) conectado. Agitar o golpear ligeramente el bolo hacia la punta de la aguja hasta que no haya burbujas de pocos o ningún restantes.

3. Inmovilización en Agar

1. Preparar una solución fresca de agar 1,2% bajo punto de fusión en agua huevo. Place solución de agar en un conjunto de baño de agua a ~ 37 ° C.
2. Preparar un cubreobjetos con cámara de registro y el lugar en el congelador (min 5-10). La cámara de grabación debe MATCh que se utiliza en la plataforma de electrofisiología. Usamos un bajo perfil baño abierto diamante cámara de imágenes de Warner Instruments (modelo RC-26GLP).
3. El uso de un Pasteur o pipeta de transferencia, coloque una larvas de pez cebra en una pequeña gota de agua de huevo en una placa de Petri plato limpio. Para esta gota, añadir una gota de solución que contiene un anestésico (0,02% tricaína) y agente paralizante (1 mg / ml de α-bungarotoxina).
4. Monitorear el pez cebra para la pérdida de movimiento (5 a 10 min).
5. Quite el cubreobjetos / cámara de registro del congelador. Coloque la cámara en la etapa de un microscopio estereoscópico. Usando una pipeta de transferencia, se mezcla con algunos mililitros de bajo punto de fusión 1,2% de agarosa con la gotita y solución de transferencia (de pescado) a la cámara de cubreobjetos / grabación.
6. Utilizando una punta de pipeta o aguja fina romo, larvas posición bajo el estereomicroscopio de modo que la cara dorsal del pescado se expone a la superficie del gel de agarosa. Permita que se endurezca agarosa (min 5-10), y luego usando una espátula plana la transferencia b agarbloquear a una cámara de grabación puede configurarse en una plataforma de electrofisiología.

3. Grabación de campo extracelular

1. Añadir 2-5 ml de medio de grabación de pez cebra para la cámara de grabación. Si los cambios son drogas cámara necesaria, perfundir con solución de grabación a una velocidad de aproximadamente 1 ml / min. No oxigenación de la solución de grabación es necesario.
2. Insertar un microelectrodo (aproximadamente 1 m diámetro de la punta, 2-7 mW) en el headstage amplificador montado en un micromanipulador de tres dimensiones. Comprobar que el micromanipulador se encuentra en una posición adecuada para permitir un rango de movimiento y ajuste. Llevar la punta microelectrodo en el plano de visión del microscopio, alta de la etapa, y el uso de ajuste grueso inferior a un punto justo por encima y ligeramente por delante de la cabeza del pez cebra.
3. Con el amplificador en "corriente-clamp" modo cero del electrodo.
4. Uso del ajuste del grueso inferior de la punta del electrodo para que apenas toque el surface del pez cebra, ligeramente por delante del prosencéfalo.
5. El uso de pasos de ajuste fino avanzar la punta del electrodo hasta que perfora la piel del pez cebra. Deje que se asiente y luego avanzar el electrodo varias micras en cerebro anterior.
6. Registrar la actividad eléctrica en modo de corriente-clamp utilizando software AxoScope. Los datos se adquirieron a una velocidad de muestreo de 10 kHz.

Resultados

Ejemplos de electrográfica convulsiva de descarga registrada en el cerebro anterior de un agar-incrustado larvas de pez cebra se muestra en la figura 1. De gran amplitud multi-pico de descarga ráfaga en estas muestras fue evocado por baño de aplicación de un fármaco anticonvulsivo, pilocarpina 40 mM (en A; 6 dpf) o 1 mM picrotoxina (en B; 8 dpf). En estas grabaciones, y inmovilizada agar-encajados pez cebra se controlan continuamente durante un máximo de 90 min. Fish siendo viable bajo estas condi...

Discusión

El método de registro extracelular presentado aquí permite un análisis muy sensible y rápida de la actividad cerebral. Estas grabaciones son análogos a electroencefalográfica (EEG) de seguimiento comúnmente utilizado para evaluar la presencia de descarga eléctrica anormal (es decir, convulsiones) en modelos de roedores de epilepsia y ¹¹ pacientes ^12. Grabaciones extracelular se puede combinar con las manipulaciones farmacológicas, como se muestra aquí. Estos tipos de grabaciones ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
Agarosa de bajo punto de fusión	Fisher Scientific-	BP1360-100	Disolver en los medios de embriones en el 1,2%
Soporte de grabación	Fisher Scientific-	BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500	1 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1,2 mM de MgCl 2, 10 mM de dextrosa, 2,1 mM CaCl 2 pH a aproximadamente 7,3 con 1 N NaOH
Tricaína	Argent Labs	MS-222	0,02%
α-bungarotoxina	Bioscience Tocris	2133	1 mg / ml
Tubo capilar de vidrio	Warner Instruments	G120TF-3	Tire a una resistencia de 2 -7 mW
Patch amplificador de pinzamiento	Warner Instruments	PC-505B	Nosotros usamos un amplificador de Warner en modo de corriente-clamp, ganancia fijó en 2 mV / Pa y filtro de Bessel fijado en 2K. Modelos comparables se pueden utilizar de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Filtro / amplificador	Cygnus Tecnología	FLA-01	Usamos un pre-amplificador de Cygnus, ganancia ajustada a 10-20; Frecuencia límite fijado en el 1-2K, filtro Notch IN. Modelos comparables se pueden utilizar de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Axon A / D bordo y software AxoScope	Molecular Devices	Axon Digidata 1320A; AxoScope 8,2	Los datos se recogen en AxoScope utilizando brecha sin modo de adquisición, el muestreo a 10 kHz. Modelos comparables y programas pueden ser utilizados de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Huevo agua	Instant Ocean		3 g de sal Instant Ocean mar, 2 ml 0,1% de azul de metileno en 10 ml de agua desionizada