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Method Article
Un método simple para registrar los potenciales de campo extracelular en el cerebro anterior de las larvas de pez cebra se describe. El método proporciona una robusta In vivo Lectura de actividades similares a convulsiones. Esta técnica se puede utilizar con larvas de pez cebra transgénico que lleva genes relacionados con la epilepsia o las convulsiones provocadas por la administración de fármacos anticonvulsivos.
La epilepsia afecta a casi 3 millones de personas en los Estados Unidos y hasta 50 millones de personas en todo el mundo. Se define como la aparición de convulsiones no provocadas espontáneos, la epilepsia puede ser adquirido como resultado de un daño cerebral o una mutación genética. Los esfuerzos para convulsiones modelo en animales han utilizado principalmente adquirido insultos (fármacos anticonvulsivos, estimulación o lesión cerebral) y las manipulaciones genéticas (knockdown antisentido, la recombinación homóloga o transgénesis) en roedores. El pez cebra son un sistema modelo vertebrado 1-3 que podría proporcionar una valiosa alternativa a los roedores investigación basada en la epilepsia. El pez cebra se utilizan extensivamente en el estudio de la genética de vertebrados o de desarrollo, presentan un alto grado de similitud genética para los mamíferos y expresar homólogos de ~ 85% de las mutaciones conocidas humanos epilepsia de un solo gen. Debido a su pequeño tamaño (4-6 mm de largo), larvas de pez cebra puede ser mantenido en volúmenes de fluido tan bajo como 100 l durante el desarrollo temprano y arraYED en múltiples pocillos. Los reactivos se pueden añadir directamente a la solución en la que se desarrollan los embriones, la simplificación de la administración del fármaco y que permite una rápida selección in vivo de compuestos de ensayo 4. Los oligonucleótidos sintéticos (morfolinos), mutagénesis, dedo de zinc nucleasa y enfoques transgénicos se pueden utilizar para generar rápidamente desmontables gen o mutación en el pez cebra 5-7. Estas propiedades costear los estudios de pez cebra sin precedentes ventaja estadística sobre el análisis del poder roedores en el estudio de los trastornos neurológicos como la epilepsia. Debido a que el "estándar de oro" para la investigación epilepsia es monitorear y analizar las descargas eléctricas anormales que se originan en una estructura del cerebro central (por ejemplo, convulsiones), un método para grabar de manera eficiente la actividad cerebral en larvas de pez cebra se describe aquí. Este método es una adaptación de las técnicas convencionales de registro extracelular y permite una estabilidad a largo plazo de vigilancia de la actividad cerebral en larvas de pez cebra intacto. Sgrabaciones amplias se muestran para las convulsiones agudas inducidas por la aplicación de fármacos anticonvulsivos baño y convulsiones espontáneas grabadas en un pez modificado genéticamente.
1. Huevo de Producción y Recolección
2. Tirando de microelectrodos y Preparación
3. Inmovilización en Agar
3. Grabación de campo extracelular
Ejemplos de electrográfica convulsiva de descarga registrada en el cerebro anterior de un agar-incrustado larvas de pez cebra se muestra en la figura 1. De gran amplitud multi-pico de descarga ráfaga en estas muestras fue evocado por baño de aplicación de un fármaco anticonvulsivo, pilocarpina 40 mM (en A; 6 dpf) o 1 mM picrotoxina (en B; 8 dpf). En estas grabaciones, y inmovilizada agar-encajados pez cebra se controlan continuamente durante un máximo de 90 min. Fish siendo viable bajo estas condi...
El método de registro extracelular presentado aquí permite un análisis muy sensible y rápida de la actividad cerebral. Estas grabaciones son análogos a electroencefalográfica (EEG) de seguimiento comúnmente utilizado para evaluar la presencia de descarga eléctrica anormal (es decir, convulsiones) en modelos de roedores de epilepsia y 11 pacientes 12. Grabaciones extracelular se puede combinar con las manipulaciones farmacológicas, como se muestra aquí. Estos tipos de grabaciones ...
No hay conflictos de interés declarado.
El autor desea dar las gracias a Pedro Castro y Dinday Mateo para sus primeros esfuerzos por establecer pez cebra en el laboratorio. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud de subvención EUREKA (# R01NS079214-01).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios (opcional) |
Agarosa de bajo punto de fusión | Fisher Scientific- | BP1360-100 | Disolver en los medios de embriones en el 1,2% |
Soporte de grabación | Fisher Scientific- | BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500 | 1 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1,2 mM de MgCl 2, 10 mM de dextrosa, 2,1 mM CaCl 2 pH a aproximadamente 7,3 con 1 N NaOH |
Tricaína | Argent Labs | MS-222 | 0,02% |
α-bungarotoxina | Bioscience Tocris | 2133 | 1 mg / ml |
Tubo capilar de vidrio | Warner Instruments | G120TF-3 | Tire a una resistencia de 2 -7 mW |
Patch amplificador de pinzamiento | Warner Instruments | PC-505B | Nosotros usamos un amplificador de Warner en modo de corriente-clamp, ganancia fijó en 2 mV / Pa y filtro de Bessel fijado en 2K. Modelos comparables se pueden utilizar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. |
Filtro / amplificador | Cygnus Tecnología | FLA-01 | Usamos un pre-amplificador de Cygnus, ganancia ajustada a 10-20; Frecuencia límite fijado en el 1-2K, filtro Notch IN. Modelos comparables se pueden utilizar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. |
Axon A / D bordo y software AxoScope | Molecular Devices | Axon Digidata 1320A; AxoScope 8,2 | Los datos se recogen en AxoScope utilizando brecha sin modo de adquisición, el muestreo a 10 kHz. Modelos comparables y programas pueden ser utilizados de acuerdo con las instrucciones del fabricante. |
Huevo agua | Instant Ocean | 3 g de sal Instant Ocean mar, 2 ml 0,1% de azul de metileno en 10 ml de agua desionizada |
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