Vorderhirn Elektrophysiologische Aufzeichnung im Larven Zebrafisch

Zusammenfassung

Eine einfache Methode, um extrazelluläre Feldpotentiale in der larvalen Zebrafisch Vorderhirn aufnehmen beschrieben. Das Verfahren bietet eine robuste In vivo Auslesen der Beschlagnahme-artige Aktivität. Diese Technik kann mit gentechnisch veränderten Zebrafischlarven tragenden Epilepsie-verwandten Genen oder Anfälle durch Verabreichung von Medikamenten Konvulsivum evozierten verwendet werden.

Zusammenfassung

Epilepsie betrifft fast 3 Millionen Menschen in den Vereinigten Staaten und bis zu 50 Millionen Menschen weltweit. Definiert als das Auftreten von spontanen Anfällen unprovozierten kann Epilepsie als Folge einer Beleidigung zum Gehirn oder einer genetischen Mutation erworben werden. Die Bemühungen um Modell Anfälle bei Tieren haben vor allem genutzt Beleidigungen (convulsant Drogen, Stimulation oder Hirnverletzungen) und genetische Manipulationen (Antisense-knockdown, homologe Rekombination oder Transgenese) in Nagetieren erworben. Zebrafische sind ein Wirbeltier Modellsystem ^1-3, die eine wertvolle Alternative zur Nagetier-basierte Epilepsieforschung bieten könnte. Zebrafische sind ausführlich in der Studie von Wirbeltier Genetik oder Entwicklung verwendet werden, weisen einen hohen Grad an Ähnlichkeit mit genetischen Säugetieren und exprimieren Homologe für ~ 85% der bekannten menschlichen monogene Epilepsie Mutationen. Aufgrund ihrer geringen Größe (4-6 mm lang), kann Zebrafischlarven in Fluidvolumen so niedrig wie 100 ul werden während der frühen Entwicklung und arra gepflegtlungsgehilfen Multi-Well-Platten. Reagenzien können direkt zu der Lösung in dem Embryonen entwickeln, die Vereinfachung Arzneimittelverabreichung und die eine rasche in-vivo-Screening von Testverbindungen ⁴ zugesetzt werden. Synthetische Oligonukleotide (Morpholinos), Mutagenese, Zink-Finger-Nuklease und transgene Ansätze können verwendet werden, um rasch zu einer Gen-knockdown oder Mutation im Zebrafisch ^5-7 werden. Diese Eigenschaften leisten Zebrafisch Studien eine beispiellose statistische Analyse Vorteil gegenüber Nagetieren in der Studie von neurologischen Erkrankungen wie Epilepsie. Da der "Goldstandard" für Epilepsie Forschung ist es, zu überwachen und zu analysieren abnorme elektrische Entladungen, die in einer zentralen Struktur des Gehirns (dh, Krampfanfälle), ein Verfahren zur effizienten Aufnahme Hirnaktivität in larvalen Zebrafisch stammen wird hier beschrieben. Diese Methode ist eine Anpassung der herkömmlichen extrazellulären Aufnahmetechniken und ermöglicht einen stabilen langfristigen Überwachung der Hirnaktivität in intakten Zebrafisch-Larven. Sreichlich Aufnahmen werden für akute Anfälle durch Bad Anwendung convulsant Drogen und spontane Anfälle in einem genetisch veränderten Fischen aufgenommen induzierte gezeigt.

Protokoll

Ein. Ei-Produktion und Sammlung

1. Zebrafisch Tierhaltung folgt Standardverfahren beschrieben ^8. Kurz gesagt, werden erwachsene Zebrafisch in Zuchtbecken mit Trennwänden in Kraft gesetzt. Wenn die Lichter im Zimmer am nächsten Morgen kommen, sind Trennwände aus Zuchtbecken und Fisch etwa 20 bis 60 min von ungestörten Paarungszeit dürfen entfernt.
2. Eier aus Zuchtbecken werden in einem Sieb gesammelt und gespült mit Ei Wasser. Eier werden dann in eine Petrischale mit Ei Wasser übertragen. Unbefruchteten Eiern und Schmutz werden mit einem Transferpipette.
3. Ort Petrischale mit der gesammelten Eier in einem Inkubator (28-32 ° C). Nach Eiern schlüpfen etwa zwei Tage nach der Befruchtung (dpf), zu entfernen Chorion und andere Ablagerungen mit einer Pipette.
4. Am gewünschten Tag nach der Befruchtung (3 bis 8 dpf) entfernen Petrischale mit frei schwimmende Larven und Platz auf dem Labortisch bei Raumtemperatur.

2. Mikroelektroden-Pulling und Vorbereitung

1. Mit einem Feinpipettenziehvorrichtung, ziehen ein 1,2 mm OD Borosilikatglas in zwei Nadeln und an einem 150 mm Petrischale oder leere Pipette box Kapillare durch Verlegung über Silly Putty Rampen. Needles können im Voraus gezogen werden. Unterschiedliche OD Glaskapillaren kann je nach Art des Verstärkers Headstage verfügbar werden.
2. Tendieren, die Mikroelektrode mit extrazellulären Aufzeichnungslösung (2 M NaCl) unter Verwendung einer 1 ml Spritze mit einer Nalgene Spritzenfilter (4-mm) und Microfil Filament (Warner Precision Instruments) befestigt ist. Schütteln oder tippen Sie den Bolus in Richtung der Nadelspitze bis es wenige oder gar keine Luftblasen mehr vorhanden sind.

3. Immobilisierung in Agar

1. Eine frische Lösung von 1,2% niedrigen Schmelzpunkt Agar in Ei Wasser. Ort Agarlösung in einem Wasserbad set bei ~ 37 ° C.
2. Bereiten Sie eine Deckglas mit Aufnahme Kammer und im Gefrierschrank (5-10 min). Die Aufnahme Kammer sollte MATCh, dass auf der Elektrophysiologie rig verwendet. Wir verwenden eine low-profile offene Raute Bad Bildgebung Kammer von Warner Instruments (Modell RC-26GLP).
3. Mit einer Pasteur oder Transferpipette, Ort ein Larvenstadium Zebrafisch in einem kleinen Tropfen von Ei-Wasser in einem sauberen Petrischale Platte. Zu dieser Tröpfchen, einen Tropfen Lösung, die ein Anästhetikum (0,02% Tricain) und lähmenden Mittels (1 mg / ml α-Bungarotoxin).
4. Überwachen Zebrafisch für den Verlust der Bewegung (5 bis 10 min).
5. Entfernen Sie das Deckglas / Aufnahme Kammer aus dem Gefrierschrank. Zeigen Kammer auf der Bühne ein Stereomikroskop. Mit einer Pipette, mischen einige ml von 1,2% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt mit Tropfen und Transfer-Lösung (mit Fisch) auf dem Deckglas / Aufnahme Kammer.
6. Mit einer Pipettenspitze oder feinen stumpfen Nadel, Position Larven unter dem Stereomikroskop, so dass die Dorsalseite der Fische zu dem Agarosegel Oberfläche ausgesetzt ist. Lassen Agarose zu härten (5-10 min), dann mit einem flachen Spatel Übertragung der Agar-bsperren, um eine Aufnahme Kammer auf einem elektrophysiologischen rig eingestellt.

3. Extrazellulären Feld Recording

1. Fügen Sie 2-5 ml Zebrafisch Speichermedien zur Aufnahme Kammer. Wenn Arzneimittel Änderungen notwendig, perfuse Kammer mit Aufzeichnungslösung mit einer Rate von etwa 1 ml / min. Kein Oxygenierung des Aufzeichnungs-Lösung erforderlich ist.
2. Einfügen einer Mikroelektrode (ca. 1 um Spitzendurchmesser, 2-7 MOhm) in den Verstärker Headstage auf einem dreidimensionalen Mikromanipulator montiert. Prüfen Sie, ob der Mikromanipulator in der richtigen Position, um für eine Reihe von Bewegung und Anpassung zu ermöglichen. Bringt die Mikroelektrode Spitze in der Sichtebene des Mikroskops, hoch über der Bühne und mit Grobeinstellung geringeren zu einem Punkt unmittelbar über und etwas vor dem Kopf des Zebrafisch.
3. Mit dem Verstärker in "Current-Clamp"-Modus Null die Elektrode.
4. Mit Grobeinstellung niedriger die Elektrodenspitze so dass es berührt nur die surface des Zebrafisches, leicht vor dem Vorderhirn.
5. Mit Feineinstellung Schritte voran die Elektrodenspitze bis er die Haut des Zebrafisch durchsticht. Absetzen lassen und dann voran die Elektrode mehreren Mikrometern in Vorderhirn.
6. Notieren elektrische Aktivität im Current-Clamp-Modus mit Axoscope Software. Daten werden mit einer Abtastrate von 10 kHz erfasst.

Ergebnisse

Beispiele für elektrografische anfallsähnliche Entladung im Vorderhirn eines Agar-embedded Zebrafischlarven aufgezeichnet sind in Abbildung 1 gezeigt. Oder 1 mM Picrotoxin (in B; 8 dpf); großer Amplitude Multi-Impuls-Burst-Entladung in diesen Proben wurde durch Anwendung eines Bades Konvulsivum Wirkstoff, 40 mM Pilocarpin (6 dpf in A) hervorgerufen. In diesen Aufnahmen, immobilisiert und Agar-Zebrafisch eingebettet werden kontinuierlich für bis zu 90 min verfolgt. Fisch bleibt unter diesen Aufnahmeb...

Diskussion

Die extrazelluläre Aufzeichnung hier vorgestellte Methode ermöglicht eine sehr sensitive und schnelle Analyse der Hirnaktivität. Diese Aufnahmen sind analog zu elektroenzephalographischen (EEG) Überwachen häufig verwendet, um das Vorhandensein von anormalen elektrischen Entladung (dh Anfall) in Nagetier-Modellen von Epilepsie ¹¹ und ¹² Patienten auszuwerten. Extrazelluläre Aufnahmen können mit pharmakologischen Manipulationen kombiniert werden, wie hier gezeigt. Diese Arten von Aufz...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt	Fisher-Scientific	BP1360-100	Man löst in Embryos Medien bei 1,2%
Speichermedien	Fisher-Scientific	BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500	1 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1,2 mM MgCl 2, 10 mM Dextrose, 2,1 mM CaCl 2 pH-Wert auf ca. 7,3 mit 1 N NaOH
Tricaine	Argent Labs	MS-222	0,02%
α-Bungarotoxin	Tocris Bioscience	2133	1 mg / ml
Kapillare Glasröhren	Warner Instruments	G120TF-3	Ziehen Sie auf einen Widerstand von 2 -7 MOhm
Patch-Clamp-Verstärkers	Warner Instruments	PC-505B	Wir verwenden ein Warner Verstärker Current-Clamp-Modus; Verstärkung bei 2 mV / pA und Bessel-Filter bei 2K eingestellt. Vergleichbare Modelle können nach den Anweisungen des Herstellers verwendet werden.
Filter / Verstärker	Cygnus Technologie	FLA-01	Wir verwenden eine Cygnus Vorverstärker; Verstärkung bei 10-20 gesetzt; Cut-off Frequenz bei 1-2K eingestellt; Notch-Filter IN. Vergleichbare Modelle können nach den Anweisungen des Herstellers verwendet werden.
Axon A / D Board und Axoscope Software	Molecular Devices	Axon Digidata 1320A; Axoscope 8,2	Daten werden in Axoscope Verwendung spaltfreie Erfassungsmodus gesammelt; Abtastung bei 10 kHz. Vergleichbare Modelle und Programme können nach den Anweisungen des Herstellers verwendet werden.
Egg Wasser	Instant Ocean		3 g Instant Ocean Meersalz, 2 ml 0,1% Methylenblau in 10 ml deionisiertem Wasser