Передний мозг Электрофизиологические записи в личинки данио рерио

Резюме

Простой метод для записи внеклеточных потенциалов поля в личиночной рыбок данио мозга описаны. Метод обеспечивает надежную В естественных условиях Чтение из захвата-подобную активность. Эта техника может быть использована с генетически модифицированными данио личинки проведения эпилепсии генов, связанных или судороги вызваны администрации судорожного наркотиков.

Аннотация

Эпилепсия затрагивает почти 3 миллиона человек в Соединенных Штатах и ​​до 50 миллионов человек по всему миру. Определяется как возникновение спонтанной неспровоцированных припадков, эпилепсии могут быть приобретены в результате оскорбления в мозг или генетической мутации. Усилия по модели припадки у животных в первую очередь использовать приобретенные оскорбления (судорожного наркотики, стимуляцию или черепно-мозговой травмы) и генетических манипуляций (антисмысловой нокдаун, гомологичной рекомбинации или трансгенез) у грызунов. Данио рерио является моделью системы позвоночных ^1-3, которые могут предоставить ценную альтернативу грызунов на основе исследования эпилепсии. Данио рерио широко используются в исследовании позвоночных генетики или развития, проявляют высокую степень генетического сходства с млекопитающими и выразить гомологов для ~ 85% известных человеческих одной мутации гена эпилепсии. Из-за своих небольших размеров (4-6 мм в длину), личинки данио рерио могут быть сохранены в объемах жидкости столь же низко как 100 мкл во время раннего развития и ARRAрый в мульти-луночных планшетах. Реагенты могут быть добавлены непосредственно в раствор, в котором развиваются эмбрионы, упрощения введения препарата и позволяет быстро в естественных условиях скрининга тестируемых соединений ^4. Синтетические олигонуклеотиды (morpholinos), мутагенеза, цинкового пальца нуклеазы и трансгенных подходов может быть использован для быстрого создания нокдаун гена или мутации у рыбок данио ^5-7. Эти свойства позволить себе рыбок данио исследования беспрецедентными статистического анализа преимуществ власть над грызунами в изучении неврологических расстройств, таких как эпилепсия. Потому что «золотым стандартом» для лечения эпилепсии исследований является мониторинг и анализ аномальных электрических разрядов, которые происходят в центральной структуры мозга (например, эпилептические припадки), метод эффективного записи активности мозга в личиночной рыбок данио описано здесь. Этот метод адаптации обычных внеклеточной методы записи и позволяет стабильный долгосрочный мониторинг активности мозга в неповрежденный личинки данио рерио. Sдостаточное записи показаны для острого шок, вызванный ванны применения судорожного наркотиков и спонтанных припадков, записанные в генетически модифицированной рыбы.

протокол

1. Производство яиц и коллекции

1. Данио рерио хозяйства следует стандартным процедурам, описанным ранее ^8. Короче говоря, взрослые данио созданы в разведении танков с перегородками на месте. Когда свет в комнате прийти на следующее утро, разделители удаляются из племенных танков и рыба разрешены примерно от 20 до 60 мин ненарушенных время спаривания.
2. Яйца из разведения танков, собранных в сито и промыть яйцо водой. Яйца затем переносят в чашку Петри с яйцом воды. Неоплодотворенные яйца и мусор удаляются с помощью передачи пипетки.
3. Место чашке Петри содержащие собранные яйца в инкубаторе (28-32 ° C). После яиц вылупляются, около двух дней после оплодотворения (DPF), удалить хориона и любой другой мусор с передачей пипетки.
4. В нужный день после оплодотворения (3 до 8 DPF) удалить чашке Петри содержащие свободно плавающих личинок и место на лабораторном столе при комнатной температуре.

2. Микроэлектродные Тяговая и подготовка

1. Использование съемника микропипетки, потяните 1,2 мм OD боросиликатного стеклянный капилляр на две иглы и магазин в 150 мм чашки Петри или пустую коробку пипеткой путем прокладки над глупыми пандусы замазкой. Иглы могут быть вытащил заранее. Различные OD стеклянные капилляры могут быть использованы в зависимости от типа усилителя headstage доступны.
2. Backload микроэлектрод с внеклеточной решение для записи (2 М NaCl) с использованием 1 мл шприц с Nalgene шприц фильтр (4-мм) и Microfil нити (Warner Precision Instruments) прилагается. Встряхните или нажмите болюса на кончике иглы, пока есть мало или совсем нет пузырьков осталось.

3. Иммобилизация в агар

1. Подготовка свежий раствор 1,2% агар низкой температурой плавления в яйце воды. Место агар решение в комплекте водяной бане при температуре ~ 37 ° C.
2. Подготовка покровное с камерой запись и место в морозильной камере (5-10 мин). Запись камеры должна MATCч, что использовались на буровой электрофизиологии. Мы используем низкопрофильных открытых алмазов ванны изображения камеры от Warner Instruments (модель RC-26GLP).
3. Использование Пастера или передачи пипетки, положите одну личиночной данио рерио в небольшой капле воды яйца в чистую тарелку чашке Петри. Для этого капля, добавьте каплю раствора, содержащего анестетик (0,02% Tricaine) и парализующий агент (1 мг / мл α-bungarotoxin).
4. Мониторинг рыбок данио за потерю движения (5 до 10 мин).
5. Удалить покровное / записи камеры с морозильной камерой. Поместите камеру на сцену стереомикроскопа. Использование передачи пипетки, смешать несколько мл 1,2% низкой температурой плавления агарозы с каплей и передачи решения (с рыбой) на покровное / записи камеры.
6. С помощью кончика пипетки или тонкой тупой иглой, положение личинки под стереомикроскопа так, что спинной части рыбы подвергается поверхность геля агарозы. Разрешить агарозы, чтобы укрепиться (5-10 мин), затем с помощью плоского шпателя передачи агар бБлокировка на запись камеры установлены на буровой электрофизиологии.

3. Внеклеточный поле записи

1. Добавить 2-5 мл среды рыбок данио записи на записи камеры. Если препарат изменения необходимы, заливать камеру с записью решения в размере около 1 мл / мин. Нет оксигенации записи решение необходимо.
2. Вставьте микроэлектрод (около 1 мкм диаметром кончика, 2-7 МОм) в усилитель headstage установленный на трехмерные микроманипулятора. Убедитесь, что микроманипулятора находится в правильном положении, чтобы обеспечить диапазон движения и регулировки. Принесите микроэлектрода чаевые в плоскость зрения микроскопа, высоко над сценой, и с помощью грубой регулировки нижнего уровня чуть выше и немного впереди глава рыбок данио.
3. С усилителя в "текущем зажим" режим нулевых электродов.
4. Использование грубой регулировки нижнего торца электрода так, чтобы она не коснется ыurface из рыбок данио, немного впереди переднего мозга.
5. При использовании тонкой регулировки шага продвижения кончик электрода, пока она прокалывает кожу рыбок данио. Дайте отстояться и затем перейти электрод несколько микрон в переднем мозге.
6. Запись электрической активности в текущем зажим режиме с использованием Axoscope программного обеспечения. Данные, полученные в частоте дискретизации 10 кГц.

Результаты

Примеры электрографических захвата типа разряда записаны в мозг из агар-встроенные личинки данио показано на рисунке 1. Большая амплитуда мульти-всплеск всплеск разряда в этих образцах был вызван ванны применения судорожного наркотиков, 40 мМ пилокарпин (в, 6 DPF) или 1 мм пикрото...

Обсуждение

Внеклеточной метод записи, представленные здесь позволяет очень чувствительный и быстрый анализ активности мозга. Эти записи аналогичны электроэнцефалографии (ЭЭГ) мониторинг обычно используется для оценки наличия аномальных электрических разрядов (например, арест) в моделях г...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (по желанию)
Низкой температурой плавления агарозы	Fisher-научным	BP1360-100	Растворите в зародыше средств массовой информации на уровне 1,2%
Носитель информации	Fisher-научным	BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500	1 мМ NaCl, 2,9 мМ KCl, 10 мМ HEPES, 1,2 мМ MgCl 2, 10 мМ глюкозы, 2,1 мМ CaCl 2 рН около 7,3 с 1 N NaOH
Tricaine	Серебряный Labs	MS-222	0,02%
α-bungarotoxin	Tocris Bioscience	2133	1 мг / мл
Капиллярная трубка стекла	Warner Instruments	G120TF-3	Потяните, чтобы сопротивление 2 -7 МОм
Усилитель патч зажим	Warner Instruments	PC-505B	Мы используем усилитель Warner в режиме текущего зажим; усиления устанавливается на 2 мВ / Па и фильтр Бесселя установлен на 2K. Сопоставимые модели могут быть использованы в соответствии с инструкцией завода-изготовителя.
Фильтр / Усилитель	Лебедь технологии	FLA-01	Мы используем Cygnus предварительного усилителя; Gain установлен на уровне 10-20; Частота среза установлен на 1-2К; Notch фильтр в. Сопоставимые модели могут быть использованы в соответствии с инструкцией завода-изготовителя.
Axon A / D платы и программного обеспечения Axoscope	Molecular Devices	Axon Digidata 1320A; Axoscope 8,2	Данные, собранные в Axoscope использование без зазоров приобретения режиме отбор проб на 10 кГц. Сопоставимые моделей и программ может быть использован в соответствии с инструкцией завода-изготовителя.
Яйцо воды	Instant Ocean		3 г мгновенных океана морской соли, 2 мл 0,1% метиленового синего в 10 мл деионизированной воды