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Method Article
ゼブラフィッシュ幼生前脳における細胞外電場電位を記録するためのシンプルな方法が記載されている。方法は、堅牢を提供発作のような活動の読み出し。この手法は、てんかん関連遺伝子または痙攣薬の投与により誘発される発作を運んで遺伝的に修飾されたゼブラフィッシュの幼虫と一緒に使用することができます。
てんかんは、米国では約300万人、最大50万人が世界中に影響を与えます。自発的ないわれのない発作の発生として定義され、てんかんは、脳や遺伝子変異に対する侮辱の結果として取得することができる。動物でのモデル発作への取り組みは、主にげっ歯類で取得侮辱(痙攣薬、刺激や脳損傷)と遺伝子操作(アンチノックダウン、相同組換えや遺伝子組み換え)を利用してきました。ゼブラフィッシュは、げっ歯類ベースのてんかんの研究に貴重な代替手段を提供することができる脊椎動物モデル系1〜3アール。ゼブラフィッシュは脊椎動物遺伝学や開発の研究で広く使用され、哺乳動物への遺伝的類似性の高度を示し、既知のヒト単一遺伝子てんかん変異の約85%のために同族を表現しています。その小さなサイズ(長さ4〜6 mm)のため、ゼブラフィッシュの幼虫を早期に開発し、ARRA中に100μlのできるだけ低い流体ボリュームで維持することができるマルチウェルプレートでyed。試薬は、薬物投与を簡素化し、試験化合物4 の in vivoスクリーニングで急速可能胚が開発した溶液に直接添加することができる。合成オリゴヌクレオチド(モルホリノ)、突然変異誘発、ジンクフィンガーヌクレアーゼとトランスジェニックアプローチが急速に5月7日 、ゼブラフィッシュの遺伝子ノックダウンや変異を生成するために使用することができます。これらのプロパティは、ゼブラフィッシュの研究にてんかんなどの神経疾患の研究では、げっ歯類の上前例のない統計的検出力分析の利点を与える。てんかん研究のための"ゴールドスタンダード"は、中央脳構造( すなわち 、発作)、効率的に幼虫のゼブラフィッシュの脳活動を記録する方法に由来する異常な放電を監視し、分析することであるため、ここで説明されます。この方法は、従来の細胞外記録技術を適応したものです、無傷のゼブラフィッシュの幼虫の脳活動の長期安定的な監視が可能となります。 S十分な録音が痙攣薬、遺伝子組み換え魚に記録されている自発的な発作の浴アプリケーションによる急性発作のために示されている。
1。卵の生産とコレクション
2。微小電極を引っ張ると準備
3。寒天で固定化
3。細胞外のフィールド録音
寒天包埋したゼブラフィッシュ幼生の前脳に記録されている電子写真発作のような放電の例を図1に示す。または1mMのピクロトキシン(Bの、8 DPF)、これらの試料中の大振幅マルチスパイクバースト放電が痙攣薬浴のアプリケーション、40mMのピロカルピン(6 DPFにおける)によって誘発された。これらの録音では、固定化され、寒天包埋したゼブラフィッシュを連続最大90分まで?...
ここに提示された細胞外記録法は、脳活動の非常に高感度で迅速な分析を可能にします。これらの録音は、一般的にてんかん患者11と12のげっ歯類モデルにおける異常放電( すなわち 、発作)の存在を評価するために使用する脳波計(EEG)の監視に類似しています。ここに示されているように外の録音は、薬理学的操作と組み合わせることができます。録音のこれらの...
特別な利害関係は宣言されません。
著者は、実験室でゼブラフィッシュを確立するために彼らの初期の努力のためにピーター·カストロとマシューDindayに感謝したいと思います。この作品は、健康EUREKAの助成金(#R01NS079214-01)の国立研究所によって資金を供給された。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
試薬の名称 | 会社 | カタログ番号 | コメント(オプション) |
低融点アガロース | フィッシャー·サイエンティフィック | BP1360-100 | 1.2%の胚メディアに溶解 |
記録媒体 | フィッシャー·サイエンティフィック | BP3581、P330-3、BP410-1、BP214-500、D16-1、C77-500 | 1 mMのNaCl、2.9 mMのKCl、10mMのHEPES、1.2mMのMgCl 2、10mMのブドウ糖、2.1 mMのCaCl 2 1N NaOHで約7.3のpH |
Tricaine | アージェント·ラボ | MS-222 | 0.02パーセント |
α-ブンガロトキシン | バイオサイエンスTocris | 2133 | 1 mg / mlの |
ガラスキャピラリーチューブ | ワーナー·インスツルメンツ | G120TF-3 | 2MΩ-7の抵抗にプル |
パッチクランプ増幅器 | ワーナー·インスツルメンツ | PC-505B | 我々は、現在のクランプモードでワーナー·アンプを使用し、ゲインは2Kに設定2 mVの/ PA、ベッセルフィルタで設定します。匹敵するモデルは、製造元の指示に従って使用することができます。 |
フィルタ/アンプ | シグナステクノロジー | FLA-01 | 我々はCygnusプリアンプを使用し、10月20日に設定されたゲイン,1-2Kに設定カットオフ周波数、ノッチフィルターに。匹敵するモデルは、製造元の指示に従って使用することができます。 |
アクソン、A / DボードとAxoscopeソフトウェア | 分子デバイス | アクソンDigidata 1320A; Axoscope 8.2 | データは、ギャップのないアクイジションモードを使用してAxoscopeに収集され、10kHzでサンプリング。匹敵するモデルとプログラムは、製造者の指示に従って使用することができます。 |
卵海水 | インスタントオーシャン | 3グラムインスタントオーシャン、海塩、10mlの脱イオン水で2 mlの0.1%メチレンブルー |
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