Larva Zebra balığı olarak önbeyin Elektrofizyolojik Kaydı

Özet

Larva zebrafish önbeyin ekstrasellüler alanın potansiyellerini kaydetmek için basit bir yöntem tarif edilmiştir. Yöntem, bir sağlam içerir In vivo Salt üzerinden aktivite nöbet gibi. Bu teknik, epilepsi ile ilişkili genlerin ya da konvülsan ilaçların verilmesi ile uyarılmış nöbetler taşıyan genetik olarak modifiye edilmiş zebrafish larvaları ile birlikte de kullanılabilir.

Özet

Epilepsi Amerika Birleşik Devletleri yaklaşık 3 milyon kişi kadar ve 50 milyon kişi dünya çapında etkiler. Spontan nöbetlerle oluşumu olarak tanımlanan, epilepsi beyin ya da genetik bir mutasyon bir hakaret sonucunda elde edilebilir. Hayvanlarda modeli nöbet çabaları öncelikle kullanılan kemirgenlerde hakaret (konvülsan ilaçlar, uyarılma ya da beyin hasarı) ve genetik manipülasyonlar (antisens demonte, homolog rekombinasyon veya transgenesis) almış. Zebra balığı kemirgen tabanlı epilepsi araştırma için değerli bir alternatif sunabilecek bir omurgalı model sistem ^1-3 vardır. Zebra balığı omurgalı genetik veya geliştirme çalışmalarında yaygın olarak kullanılan, memeliler için genetik benzerlik yüksek dereceli ve bilinen insan tek gen epilepsi mutasyonların ~% 85 homologları ifade. Çünkü onların küçük boyutlu (4-6 mm uzunlukta) arasında zebrafish larva erken gelişim ve arra sırasında 100 ul gibi düşük sıvı hacmi muhafaza edilebilirçok oyuklu plakalar içinde yapabilirler. Reaktifler embriyolar ilaç uygulaması basitleştirilmesi ve test bileşiklerinin in vivo ⁴ tarama hızlı sağlayan, geliştiği çözeltiye doğrudan ilave edilebilir. Sentetik oligonükleotidler (morpholinos), mutagenez, çinko parmak nükleaz ve transgenik yaklaşımlar hızla ^5-7 zebrafish gen devirme veya mutasyon oluşturmak için de kullanılabilir. Bu özellikler zebrafish çalışmalarda epilepsi gibi nörolojik hastalıkların çalışmada kemirgenler üzerinde görülmemiş bir istatistiksel güç analizi avantajı göze. Epilepsi araştırma için "altın standart" merkezi bir beyin yapısı (yani, nöbetler), verimli larva zebrafish beyin aktivitesini kaydetmek için bir yöntem menşeli anormal elektrik deşarjı izlemek ve analiz etmek için burada tanımlanmıştır. Bu yöntem geleneksel ekstraselüler kayıt teknikleri bir uyarlamasıdır ve sağlam zebrafish larvaları beyin aktivitesinin istikrarlı, uzun vadeli izleme için izin verir. Sbol kayıtları bir genetiği değiştirilmiş balık kaydedilen konvülsan ilaçlar ve spontan nöbetlerin banyo uygulaması ile oluşturulan akut nöbetler için gösterilmiştir.

Protokol

1. Yumurta Üretim ve Toplama

1. Zebra balığı yetiştiriciliği daha önce ⁸ açıklanan standart prosedürleri izler. Kısaca, yetişkin zebrafish yerde bölücüler ile tanklar üreme kurulur. Oda ışıkları ertesi sabah geldiğinde, bölücüler tank ve balık rahatsız çiftleşme zamanı yaklaşık 20 ila 60 dakika izin üreme kaldırılır.
2. Yetiştirme tanklarından Yumurta bir süzgeç toplanır ve yumurta su ile durulanır. Yumurta sonra yumurta su ile bir Petri kabı aktarılır. Döllenmemiş yumurtalar ve enkaz bir transfer pipet kullanarak kaldırılır.
3. Küvözde toplanan yumurtalar (28-32 ° C) içeren Sıra Petri. Yumurta iki gün sonrası fertilizasyon (DPF) etrafında, yumurtadan sonra, bir transfer pipet ile koryon ve diğer pislikleri temizleyin.
4. İstediğiniz gün sonrası fertilizasyon (3 ila 8 DPF) oda sıcaklığında laboratuarlarında serbestçe yüzme larva ve yeri içeren Petri çıkarın.

2. Mikroelektrod Çekme ve Hazırlama

1. Bir mikropipet çektirmenin kullanarak, 1.2 mm OD borosilikat cam aptalca macun rampalarda koyarak bir 150 mm Petri kabında ya da boş pipet kutusunda iki iğne ve mağaza içine kılcal çekin. İğneler önceden çekilebilir. Farklı OD cam kılcal mevcut amplifikatör headstage türüne bağlı olarak kullanılabilir.
2. Nalgene bir şırınga filtresi (4-mm) ve Mikrofil filaman (Warner Precision Instruments) takılı olan bir 1 ml şırınga kullanarak hücre dışı kayıt solüsyonu (2 M NaCl) ile Backload mikroelektrot. Kalan az veya hiç kabarcığı kalmayıncaya kadar iğne ucuna doğru bolus çalkalayın ya dokunun.

3. Agar İmmobilizasyon

1. Yumurta suda% 1.2 düşük erime noktası agar taze bir çözüm hazırlayın. ~ 37 ° C'de bir su banyosunda grubu içinde yer agar çözeltisi
2. Dondurucuya kayıt odasına ve yeri (5-10 dk) ile bir lamel hazırlayın. Kayıt odasına Matc gerekirh bu elektrofizyoloji teçhizat kullanılır. Biz Warner Instruments (Model RC-26GLP) bir düşük profilli açık elmas hamamı görüntüleme odası kullanın.
3. Pasteur veya transfer pipet, temiz bir Petri plaka yumurta su küçük bir damlacık yer biri larva zebrafish kullanma. Bu damlacık için, bir anestetik (% 0.02 tricaine) ve felç edici ajan (1 mg / ml α-bungarotoxin) ihtiva eden bir çözelti damla ilave edin.
4. Hareket kaybı (5-10 dk) için zebrafish izler.
5. Dondurucu lamel / kayıt odasına çıkarın. Stereomikroskopta evresine odasına yerleştirin. Bir transfer pipet kullanarak, damlacık ve lamel / kayıt odasına aktarım çözümü (balık) ile% 1.2 düşük erime noktası agaroz birkaç ml karıştırın.
6. Bir pipet veya ince künt iğne, balık dorsalinde agaroz jel yüzeyine maruz böylece stereomikroskop altında pozisyon larva kullanma. Sonra düz bir spatula transferi agar b kullanarak, sertleşmeye (5-10 dk) agaroz İzinBir elektrofizyoloji kulesi kurmak bir kayıt odasına kilitleyin.

3. Ekstrasellüler Alan Kaydı

1. Kayıt odasına zebrafish kayıt ortamı 2-5 ml ekleyin. Ilaç değişiklikler yaklaşık 1 ml / dak 'lık bir hızla kayıt solüsyonu ile gerektiğinde, perfuse bölme ise. Kayıt çözelti No oksijen gereklidir.
2. , Üç boyutlu bir mikromanipülatör üzerine monte edilmiş olan amplifikatör headstage içine bir mikroelektrot (yaklaşık 1 mikron uç çapı, MΩ 2-7) takın. Mikromanipülatör hareketi ve ayar bir dizi için izin vermek için uygun bir konumda olup olmadığını kontrol edin. Sahneden yüksek mikroskop görünümü düzlem, ve sadece yukarıda ve biraz zebrafish kafası önünde bir noktaya daha düşük kaba ayarı kullanarak içine mikroelektrot ucu getir.
3. "Akım-kelepçe" modunda sıfır elektrodunda amplifikatör ile.
4. Sadece s dokunacak şekilde kaba ayarı düşük elektrot ucu kullanarakhafifçe ön beyin önünde zebrafish urface.
5. Bu zebrafish cildi delen, kadar ince ayar adımları kullanarak elektrot ucu ilerlemek. Önbeyin içine birkaç mikron yerleşmek ve sonra elektrot ilerlemek için izin ver.
6. Axoscope yazılımını kullanarak akım-klemp modunda elektriksel aktivite kaydedin. Veri 10 kHz örnekleme hızında elde edilir.

Sonuçlar

Bir agar-gömülü zebrafish larvalarının ön beyin kaydedilen elektrografik nöbet gibi deşarj örnekleri Şekil 1 'de gösterilmiştir. Veya 1 mM picrotoxin (B; 8 dpf); bu örneklerdeki Büyük genlikli çoklu başak patlama boşalma konvülsan ilacın banyo uygulaması, 40 mM pilokarpin (6 dpf'e A) tarafından uyarılmış oldu. Bu kayıtlar içinde, immobilize ve agar-gömülü zebrafish sürekli 90 dk kadar izlenir. Balık kadar 24 saat için bu kayıt koşullarında canlı kalır. İla?...

Tartışmalar

Burada sunulan ekstraselüler kayıt yöntemi, beyin aktivitesinde çok hassas ve hızlı analizine olanak sağlar. Bu kayıtlar genellikle epilepsi ¹¹ ve hastaların ¹² kemirgen modellerinde anormal elektriksel deşarj (yani, nöbet) varlığını değerlendirmek için kullanılan elektroensefalografi (EEG) izleme ile benzerdir. Burada gösterildiği gibi ekstraselüler kayıtları, farmakolojik manipülasyonlar ile kombine edilebilir. Kayıtları Bu tip de genetik olarak modifiye edilmi?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
Agaroz düşük erime	Fisher-Bilimsel	BP1360-100	% 1,2 embriyo ortamda çözülür
Kayıt ortamı	Fisher-Bilimsel	BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500	1 mM NaCI, 2.9 mM KCI, 10 mM HEPES, 1.2 mM MgCl2, 10 mM dekstroz, 2.1 mM CaCl2 1 N NaOH ile pH değeri yaklaşık olarak 7.3 ile
Tricaine	Argent Laboratuvarları	MS-222	% 0.02 '
α-bungarotoxin	Bioscience Tocris	2133	1 mg / ml
Kılcal cam boru	Warner Instruments	G120TF-3	MΩ 2 -7 bir direnç çekin
Yama kelepçe amplifikatör	Warner Instruments	PC-505B	Biz mevcut-klemp modunda bir Warner amplifikatör kullanmak; Kazanç 2K ayarlanır 2 mV / pA ve Bessel filtre ayarlanmıştır. Karşılaştırılabilir model üreticinin talimatlarına göre kullanılır.
Filtre / amplifikatör	Kuğu Teknoloji	FLA-01	10-20 ayarlanır Kazanç;; 1-2K ayarlanmış Kesim frekansı; Notch filtresi IN Biz Cygnus pre-amplifikatör kullanın. Karşılaştırılabilir model üreticinin talimatlarına göre kullanılır.
Akson A / D kurulu ve Axoscope yazılımı	Molecular Devices	Akson Digidata 1320A; Axoscope 8.2	Veri boşluğu serbest edinimi modunu kullanarak Axoscope toplanır; 10 kHz örnekleme. Karşılaştırılabilir modelleri ve programları üreticinin talimatlarına göre kullanılır.
Yumurta su	Anında Okyanus		3 g Anında Okyanusu deniz tuzu, 10 ml deiyonize su içinde 2 mL% 0.1 'lik metilen mavisi