Proencefalo registrazione elettrofisiologica in larvale Zebrafish

Riepilogo

Un metodo semplice per registrare potenziali di campo extracellulari nel proencefalo larvale zebrafish è descritto. Il metodo fornisce un robusto In vivo Lettura di sequestro un'attività simile. Questa tecnica può essere utilizzata con le larve di zebrafish geneticamente modificati portando epilessia geni correlati o convulsioni evocate dalla somministrazione di farmaci convulsivanti.

Abstract

L'epilessia colpisce circa 3 milioni di persone negli Stati Uniti e fino a 50 milioni di persone in tutto il mondo. Definito come il verificarsi di convulsioni non provocate spontanee, epilessia può essere acquisita a seguito di un insulto al cervello o una mutazione genetica. Gli sforzi per sequestri modello su animali hanno principalmente utilizzato acquisito insulti (farmaci convulsivanti, stimolazione o lesione cerebrale) e manipolazioni genetiche (atterramento antisenso, ricombinazione omologa o transgenesi) nei roditori. Zebrafish sono un sistema modello vertebrato ^1-3 che potrebbe fornire una valida alternativa al roditore ricerca basata epilessia. Zebrafish sono ampiamente utilizzati nello studio dei vertebrati genetica o di sviluppo, presentano un elevato grado di somiglianza genetica ai mammiferi ed esprimere omologhi per ~ 85% di umani noti singolo gene mutazioni epilessia. A causa delle loro piccole dimensioni (4-6 mm di lunghezza), larve di zebrafish può essere mantenuta in volumi di fluido a partire da 100 pl durante lo sviluppo precoce e ARRAYED in multi-pozzetti. I reagenti possono essere aggiunti direttamente alla soluzione in cui gli embrioni sviluppano, semplificando la somministrazione del farmaco e consentendo un rapido screening in vivo di composti di prova ^4. Oligonucleotidi sintetici (Morpholinos), mutagenesi, zinc finger nucleasi e approcci transgenici possono essere utilizzati per generare rapidamente knockdown gene o mutazione in zebrafish ^5-7. Queste proprietà permettersi studi zebrafish senza precedenti analisi statistica vantaggio potere roditori nello studio di disturbi neurologici come l'epilessia. Poiché il "gold standard" per la ricerca l'epilessia è quello di monitorare e analizzare le scariche elettriche anomale che hanno origine in una struttura cerebrale centrale (ad esempio, convulsioni), un metodo per registrare in modo efficiente l'attività cerebrale in larvale zebrafish è descritto qui. Questo metodo è un adattamento dei tradizionali tecniche di registrazione extracellulari e permette stabile monitoraggio a lungo termine di attività cerebrale in larve di zebrafish intatto. Sregistrazioni ampie sono mostrate per crisi acute indotte da bagno applicazione di farmaci convulsivanti e sequestri spontanei registrati in un pesce geneticamente modificato.

Protocollo

1. Uovo di produzione e raccolta

1. Zebrafish allevamento segue le procedure standard descritte in precedenza ^8. In breve, zebrafish adulti vengono impostate in acquari di riproduzione con divisori in atto. Quando le luci in sala si accendono la mattina seguente, divisori vengono rimossi da acquari di riproduzione e pesci sono autorizzati circa 20 a 60 minuti di tempo di accoppiamento indisturbato.
2. Uova da vasche di allevamento sono raccolti in un colino e sciacquato con acqua uovo. Uova vengono poi trasferiti ad una piastra di Petri con acqua uovo. Uova non fecondate e detriti vengono rimossi con una pipetta di trasferimento.
3. Luogo piatto Petri contenente le uova raccolte in un incubatore (28-32 ° C). Dopo le uova si schiudono, circa due giorni dopo la fecondazione (dpf), rimuovere corion e altri detriti con una pipetta di trasferimento.
4. Il giorno desiderato post-fertilizzazione (3-8 dpf) rimuovere piastra Petri contenente larve liberamente nuoto e posto sul banco del laboratorio a temperatura ambiente.

2. Microelettrodo Pulling e preparazione

1. Utilizzando un estrattore micropipetta, tirare un mm 1,2 diametro esterno in vetro borosilicato capillare in due aghi e conservare in un piatto 150 millimetri Petri o scatola vuota pipetta da posa su rampe Silly Putty. Aghi può essere tirato in anticipo. Diversa OD capillari di vetro possono essere utilizzati a seconda del tipo di amplificatore headstage disponibili.
2. Ritardare l'microelettrodo con soluzione di registrazione extracellulare (2 M NaCl) utilizzando una siringa da 1 ml con una siringa Nalgene filtro (4 mm) e Microfil filamento (Warner Precision Instruments) allegata. Agitare o picchiettare il bolo verso la punta dell'ago fino a quando non ci sono bolle o non ancora.

3. Immobilizzazione in Agar

1. Preparare una soluzione fresca di 1,2% agar a basso punto di fusione in acqua uovo. Soluzione da agar in un set da bagno di acqua a ~ 37 ° C.
2. Preparare un vetrino con la camera di registrazione e mettere in freezer (5-10 minuti). La camera di registrazione dovrebbe MATCh quello utilizzato sulla piattaforma elettrofisiologia. Usiamo un basso profilo aperto bagno camera di diamante immagini da Warner Instruments (RC-26GLP).
3. Usando una pipetta Pasteur o il trasferimento, mettere un pesce zebra larvale in una goccia d'acqua uovo in un piatto pulito piastra di Petri. Per questo gocciolina, aggiungere una goccia di soluzione contenente un anestetico (0,02% tricaine) e agente paralizzante (1 mg / ml α-bungarotossina).
4. Monitorare zebrafish per la perdita di movimento (da 5 a 10 minuti).
5. Rimuovere il coprioggetto / camera di registrazione dal congelatore. Posizionare camera sul palco di uno stereomicroscopio. Usando una pipetta di trasferimento, mescolare alcuni millilitri di 1,2% di agarosio a basso punto di fusione con la gocciolina e la soluzione di trasferimento (con pesce) al coprioggetto / registrazione da camera.
6. Utilizzando un puntale o con ago sottile smussato, larve posizione sotto lo stereomicroscopio in modo che la parte dorsale del pesce è esposto alla superficie del gel di agarosio. Lasciar indurire agarosio (5-10 minuti), quindi utilizzando un trasferimento spatola piatta del b agarbloccare ad una camera di registrazione impostato su una piattaforma elettrofisiologia.

3. Campo di registrazione extracellulare

1. Aggiungere 2-5 ml di supporti di registrazione zebrafish alla camera di registrazione. Se droga cambiamenti sono necessari, camera profumato con soluzione di registrazione ad una velocità di circa 1 ml / min. No ossigenazione della soluzione di registrazione è necessaria.
2. Inserire un microelettrodo (circa 1 micron di diametro punta, 2-7 MW) nel headstage amplificatore montato su un tridimensionale micromanipolatore. Controllare che il micromanipolatore è in una posizione appropriata per consentire una gamma di movimento e regolazione. Portare la punta microelettrodo nel piano di vista del microscopio, alto fuori fase, e con regolazione grossolana inferiore ad un punto appena sopra e leggermente davanti alla testa della zebrafish.
3. Con l'amplificatore in modalità "current-clamp" zero dell'elettrodo.
4. Uso della regolazione grossolana abbassare la punta dell'elettrodo in modo che tocchi solo la surface del zebrafish, leggermente davanti proencefalo.
5. Usare passi di regolazione fine avanzare la punta dell'elettrodo fino perfora la pelle del zebrafish. Lasciar depositare e poi avanzare l'elettrodo alcuni micron nel proencefalo.
6. Registrare l'attività elettrica in current-clamp mode utilizzando il software Axoscope. I dati vengono acquisiti ad una frequenza di campionamento di 10 kHz.

Risultati

Esempi di elettrografico sequestro-come scarico registrata nel proencefalo di agar-embedded larve zebrafish sono mostrati nella Figura 1. Grande ampiezza multi-picco di scarico scoppio in questi campioni è stata evocata da bagno applicazione di un farmaco convulsivante, 40 pilocarpina mM (in A, 6 dpf) o 1 picrotossina mM (in B, 8 dpf). In queste registrazioni, immobilizzato e agar-embedded zebrafish sono continuamente monitorati per un massimo di 90 min. Pesce rimangono vitali in queste condizioni di r...

Discussione

Il metodo di registrazione extracellulare qui presentata consente un'analisi molto sensibile e rapida di attività cerebrale. Queste registrazioni sono analoghi a elettroencefalografico (EEG) monitoraggio comunemente utilizzato per valutare la presenza di scarica elettrica anomala (cioè, sequestro) in modelli di roditori di epilessia ¹¹ e ¹² pazienti. Registrazioni extracellulari possono essere combinati con manipolazioni farmacologiche, come illustrato di seguito. Questi tipi di regi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
Agarosio basso punto di fusione	Fisher Scientific-	BP1360-100	Sciogliere in mezzi embrioni a 1,2%
Supporti di registrazione	Fisher Scientific-	BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500	1 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 10 mM di HEPES, 1,2 mM MgCl2, 10 mM destrosio, 2,1 mM CaCl 2 pH a circa 7,3 con NaOH 1 N
Tricaine	Argent Labs	MS-222	0,02%
α-bungarotossina	Bioscience Tocris	2133	1 mg / ml
Vetro tubo capillare	Warner Instruments	G120TF-3	Tirare per una resistenza di 2 -7 MW
Patch clamp amplificatore	Warner Instruments	PC-505B	Usiamo un amplificatore Warner in modalità current-clamp; guadagno fissato a 2 mV / pA e del filtro di Bessel fissato a 2K. Modelli comparabili può essere utilizzato in base alle istruzioni del produttore.
Filtro / amplificatore	Cygnus Tecnologia	FLA-01	Usiamo un Cygnus pre-amplificatore; guadagno fissato a 10-20; Frequenza di taglio impostato a 1-2K, Filtro Notch IN. Modelli comparabili può essere utilizzato in base alle istruzioni del produttore.
Axon scheda A / D e il software Axoscope	Molecular Devices	Axon Digidata 1320A; Axoscope 8,2	I dati vengono raccolti in Axoscope con gap-free modalità di acquisizione, campionamento a 10 kHz. Modelli comparabili e programmi possono essere utilizzati secondo le istruzioni del produttore.
Egg acqua	Instant Ocean		3 g immediata Oceano mare sale, 2 ml di blu di metilene 0,1% in 10 ml di acqua deionizzata