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Method Article
Un metodo semplice per registrare potenziali di campo extracellulari nel proencefalo larvale zebrafish è descritto. Il metodo fornisce un robusto In vivo Lettura di sequestro un'attività simile. Questa tecnica può essere utilizzata con le larve di zebrafish geneticamente modificati portando epilessia geni correlati o convulsioni evocate dalla somministrazione di farmaci convulsivanti.
L'epilessia colpisce circa 3 milioni di persone negli Stati Uniti e fino a 50 milioni di persone in tutto il mondo. Definito come il verificarsi di convulsioni non provocate spontanee, epilessia può essere acquisita a seguito di un insulto al cervello o una mutazione genetica. Gli sforzi per sequestri modello su animali hanno principalmente utilizzato acquisito insulti (farmaci convulsivanti, stimolazione o lesione cerebrale) e manipolazioni genetiche (atterramento antisenso, ricombinazione omologa o transgenesi) nei roditori. Zebrafish sono un sistema modello vertebrato 1-3 che potrebbe fornire una valida alternativa al roditore ricerca basata epilessia. Zebrafish sono ampiamente utilizzati nello studio dei vertebrati genetica o di sviluppo, presentano un elevato grado di somiglianza genetica ai mammiferi ed esprimere omologhi per ~ 85% di umani noti singolo gene mutazioni epilessia. A causa delle loro piccole dimensioni (4-6 mm di lunghezza), larve di zebrafish può essere mantenuta in volumi di fluido a partire da 100 pl durante lo sviluppo precoce e ARRAYED in multi-pozzetti. I reagenti possono essere aggiunti direttamente alla soluzione in cui gli embrioni sviluppano, semplificando la somministrazione del farmaco e consentendo un rapido screening in vivo di composti di prova 4. Oligonucleotidi sintetici (Morpholinos), mutagenesi, zinc finger nucleasi e approcci transgenici possono essere utilizzati per generare rapidamente knockdown gene o mutazione in zebrafish 5-7. Queste proprietà permettersi studi zebrafish senza precedenti analisi statistica vantaggio potere roditori nello studio di disturbi neurologici come l'epilessia. Poiché il "gold standard" per la ricerca l'epilessia è quello di monitorare e analizzare le scariche elettriche anomale che hanno origine in una struttura cerebrale centrale (ad esempio, convulsioni), un metodo per registrare in modo efficiente l'attività cerebrale in larvale zebrafish è descritto qui. Questo metodo è un adattamento dei tradizionali tecniche di registrazione extracellulari e permette stabile monitoraggio a lungo termine di attività cerebrale in larve di zebrafish intatto. Sregistrazioni ampie sono mostrate per crisi acute indotte da bagno applicazione di farmaci convulsivanti e sequestri spontanei registrati in un pesce geneticamente modificato.
1. Uovo di produzione e raccolta
2. Microelettrodo Pulling e preparazione
3. Immobilizzazione in Agar
3. Campo di registrazione extracellulare
Esempi di elettrografico sequestro-come scarico registrata nel proencefalo di agar-embedded larve zebrafish sono mostrati nella Figura 1. Grande ampiezza multi-picco di scarico scoppio in questi campioni è stata evocata da bagno applicazione di un farmaco convulsivante, 40 pilocarpina mM (in A, 6 dpf) o 1 picrotossina mM (in B, 8 dpf). In queste registrazioni, immobilizzato e agar-embedded zebrafish sono continuamente monitorati per un massimo di 90 min. Pesce rimangono vitali in queste condizioni di r...
Il metodo di registrazione extracellulare qui presentata consente un'analisi molto sensibile e rapida di attività cerebrale. Queste registrazioni sono analoghi a elettroencefalografico (EEG) monitoraggio comunemente utilizzato per valutare la presenza di scarica elettrica anomala (cioè, sequestro) in modelli di roditori di epilessia 11 e 12 pazienti. Registrazioni extracellulari possono essere combinati con manipolazioni farmacologiche, come illustrato di seguito. Questi tipi di regi...
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
L'autore desidera ringraziare Peter Castro e Matteo Dinday per i loro primi sforzi per stabilire zebrafish in laboratorio. Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health EUREKA sovvenzione (# R01NS079214-01).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti (opzionale) |
Agarosio basso punto di fusione | Fisher Scientific- | BP1360-100 | Sciogliere in mezzi embrioni a 1,2% |
Supporti di registrazione | Fisher Scientific- | BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500 | 1 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 10 mM di HEPES, 1,2 mM MgCl2, 10 mM destrosio, 2,1 mM CaCl 2 pH a circa 7,3 con NaOH 1 N |
Tricaine | Argent Labs | MS-222 | 0,02% |
α-bungarotossina | Bioscience Tocris | 2133 | 1 mg / ml |
Vetro tubo capillare | Warner Instruments | G120TF-3 | Tirare per una resistenza di 2 -7 MW |
Patch clamp amplificatore | Warner Instruments | PC-505B | Usiamo un amplificatore Warner in modalità current-clamp; guadagno fissato a 2 mV / pA e del filtro di Bessel fissato a 2K. Modelli comparabili può essere utilizzato in base alle istruzioni del produttore. |
Filtro / amplificatore | Cygnus Tecnologia | FLA-01 | Usiamo un Cygnus pre-amplificatore; guadagno fissato a 10-20; Frequenza di taglio impostato a 1-2K, Filtro Notch IN. Modelli comparabili può essere utilizzato in base alle istruzioni del produttore. |
Axon scheda A / D e il software Axoscope | Molecular Devices | Axon Digidata 1320A; Axoscope 8,2 | I dati vengono raccolti in Axoscope con gap-free modalità di acquisizione, campionamento a 10 kHz. Modelli comparabili e programmi possono essere utilizzati secondo le istruzioni del produttore. |
Egg acqua | Instant Ocean | 3 g immediata Oceano mare sale, 2 ml di blu di metilene 0,1% in 10 ml di acqua deionizzata |
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