Ensayo de alto rendimiento basado en células citometría de flujo para detectar anticuerpos a la N-metil-D-aspartato receptor o dopamina-2 del receptor en suero humano

Resumen

Durante los últimos años, los ensayos basados ​​en células vivas se han utilizado con éxito para detectar anticuerpos contra antígenos de superficie y conformacionales. Aquí se describe un método que utiliza el flujo de alto rendimiento citometría permite el análisis de grandes cohortes de pacientes. La detección de nuevos anticuerpos será mejorar el diagnóstico y el tratamiento de trastornos del sistema inmune-mediada.

Resumen

Durante los últimos años, los anticuerpos contra las proteínas de superficie y conformacionales implicados en la neurotransmisión se han detectado en las enfermedades autoinmunes del sistema nervioso central en niños y adultos. Estos anticuerpos se han utilizado para guiar el diagnóstico y el tratamiento. Ensayos basados ​​en células han mejorado la detección de anticuerpos en el suero del paciente. Se basan en la expresión de superficie de antígenos del cerebro en las células eucariotas, que luego se incubaron con sueros de paciente diluida seguido por anticuerpos secundarios conjugados con fluorocromo. Después del lavado, el anticuerpo secundario de unión se analizó a continuación por citometría de flujo. Nuestro grupo ha desarrollado un flujo de alto rendimiento de la citometría de ensayo basado en células vivas para detectar de forma fiable anticuerpos contra los receptores de neurotransmisores específicos. Este método de citometría de flujo es sencillo, cuantitativa, eficiente, y el uso de un sistema de toma de muestras de alto rendimiento permite grandes cohortes de pacientes que se sometieron a ensayo fácilmente en un corto espacio de tiempo. Además, esta basado en células comodecir se puede adaptar fácilmente para detectar anticuerpos a muchas dianas antigénicas diferentes, tanto desde el sistema nervioso central y la periferia. El descubrimiento de biomarcadores de anticuerpos novela adicionales permitirá un diagnóstico precoz y preciso y mejorar el tratamiento de los trastornos autoinmunes.

Introducción

En los últimos años, se han identificado formas autoinmunes del sistema nervioso central (SNC) enfermedades. Se ha demostrado que estas enfermedades están asociadas y definen por la presencia de autoanticuerpos. Estos anticuerpos se unen a los receptores neuronales o proteínas sinápticas implicadas en la neurotransmisión ^1,2. Diferentes antígenos se han detectado, tales como receptor de N-metil-D-aspartato (NMDAR) ^3-5, receptor de γ-aminobutírico B (GABA _B) del receptor ^6, α-amino-3-hidroxi-5-metil-4- ácido isoxazolpropiónico (AMPA) ^7, el canal de potasio dependiente de voltaje (VGKC) proteínas asociadas: rica en leucina 1 glioma proteínas activadas (LGL-1) y contactina asociada a la proteína 2 (capsr2) receptor de ^8,9, glutamato ^5,10 , y la dopamina-2 del receptor (D2R) ^11. En el pasado, estos trastornos del SNC autoinmunes (principalmente llamados encefalitis) eran a menudo sin diagnosticar y sin tratar. Estos biomarcadores de anticuerpos novedosos, por ejemplo,Anticuerpos NMDAR o anticuerpo D2R, han mejorado sustancialmente el diagnóstico y la sensibilización, y se han abierto las opciones de tratamiento para los pacientes. De hecho, el tratamiento temprano con inmunoterapias se asocia con un mejor resultado ^11,12.

Los métodos tradicionales para detectar anticuerpos, tales como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y Western Blot se han utilizado para la detección de anticuerpos en el suero. Sin embargo, no permiten fácilmente el reconocimiento de epítopos extracelulares o de superficie y, más bien, pueden revelar inmunorreactividad hacia un epítopo intracelular. Además, los anticuerpos que se unen al dominio extracelular de las proteínas importantes implicadas en la neurotransmisión es probable que sean ^2,3,7,13,14 patógena. Por lo tanto, el desarrollo de ensayos precisos y sensibles para descubrir superficie de la célula relevante o los objetivos de anticuerpos extracelulares en los pacientes es de suma importancia. El método estándar de oro en el campo se basa en el uso de células vivas, en la así llamada "célula-BAensayos de sed ". Este método implica la expresión de un antígeno en la superficie de células de mamíferos (de riñón (293) más a menudo células embrionarias humanas HEK293) en su forma nativa por la transfección de vectores que contienen la secuencia completa de ADNc del antígeno de interés. Nonpermeabilized células vivas se incubaron después con suero diluido del paciente y seguidas por-fluorocromo conjugado anti-inmunoglobulina humana (Ig) anticuerpo secundario. Después se detecta la intensidad o nivel de fluorescencia y se asocia con el nivel de unión de autoanticuerpos. Esta técnica es específica, ya que sólo un antígeno se sobreexpresa en las células. El más ampliamente utilizado "lectura" ha sido el análisis de microscopía confocal después de inmunocitoquímica ^4,5,8-10. Sin embargo, la citometría de flujo ensayos basados ​​en células se han utilizado con éxito para detectar anticuerpos en pacientes con enfermedades desmielinizantes ^15-17. En particular, Waters et al. ¹⁵ compararon la detección de anticuerpos usando una cacerolaEL de técnicas de detección de anticuerpos, incluyendo ensayos basados ​​en células, seguido por microscopía o el flujo de análisis de citometría, y ha demostrado citometría de flujo ensayo basado en células para ser el método más sensible, preciso y fiable. Por lo tanto, citometría de flujo ensayo basado en células es ventajosa, ya que es cuantitativo, no investigador-dependiente, y no implica ningún uso de material radiactivo. También es conveniente, ya que permite a las grandes cohortes de pacientes que se sometieron a ensayo en un corto período de tiempo.

Más recientemente, hemos optimizado un flujo de alto rendimiento citometría de ensayo basado en células para detectar anticuerpos de NMDAR y D2R anticuerpo en pacientes con enfermedades autoinmunes del sistema nervioso central ^11. Nuestro grupo detectado recientemente anticuerpo de NMDAR en sueros de pacientes usando citometría de flujo ensayo basado en células. Estos NMDAR sueros anticuerpos positivos fueron analizados previamente por microscopía confocal y también resultaron ser positivos ^11. Este protocolo describe una citometría de flujo ensayo basado en células para la detección de canticuerpo SNC onformation-sensible en el suero del paciente utilizando un muestreador automatizado de alto rendimiento.

Protocolo

1. Subclonación Estrategia para Construir pIRES2-EGFP vector que codifica D2R o NMDAR

1. Obtener ADNc de longitud completa clon de D2R humano o de NMDAR subunidad 1 (NR1).
2. Elija un vector de expresión, tal como pIRES2-EGFP, que es adecuado para la expresión de proteínas de transmembrana con una proteína verde fluorescente (GFP) indicador bajo el control de un sitio de entrada interna del ribosoma (IRES), permite que tanto los antígenos y GFP para ser coexpressed en células por separado.
3. Subclónese ADNc humano dentro de pIRES2-EGFP del vector.
   1. Para subclonar ADNc, utilizar enzimas de restricción apropiadas (por ejemplo NheI y XhoI para D2R ADNc humano).
   2. CDNA corte Ligar insertar dentro restringido vector pIRES2-EGFP.
   3. Secuencia ligada pIRES2-EGFP D2R o NMDAR vector para comprobar si el vector contiene la secuencia correcta.
   4. Purifica y amplificar D2R pIRES2-EGFP o NMDAR vector para su posterior uso en la transfección.

í tulo "> 2. HEK293 La transfección de células para la expresión de antígeno neuronal

1. Células de cultivo HEK293 en matraces de cultivo de tejidos con medio Eagle modificado fresco de Dulbecco (1x) (DMEM) completo con 4,5 g / l de D-glucosa, L-glutamina y 110 mg / piruvato de sodio L suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS), 2 mM de GlutaMAX, y 50 mg / ml de gentamicina.
2. Separar las células HEK293 usando tripsina y la transferencia a un tubo cónico.
   1. Lavar las células por centrifugación a 250 xg durante 6 min y resuspender el sedimento de células en DMEM completo fresco.
3. Contar las células y placas de semillas 6 pocillos a aproximadamente 8 x 10 ⁵ células / pocillo y la cultura durante la noche en DMEM 2 ml a 37 ° C y 5% de CO ₂ en una incubadora.
4. Una vez que han llegado a cerca del 70% de confluencia, transfectar las células HEK293 con pIRES2-EGFP NR1 (células HEK293 ^{NMDAR +),} pIRES2-EGFP D2R ⁽⁺ células HEK293 ^D2R), y (células HEK293 ^CTL; control de vectores) pIRES2-EGFP de la siguiente manera.Mantenga algunas células HEK293 transfectadas de indemnización más adelante.
   1. Preparar el volumen necesario de mezcla de transfección que comprende 2,5 g de ADN, 200 l de cloruro de sodio 0,9% y 4 mg / ml de polietilenimina / pocillo (cada uno conteniendo 2 ml de DMEM completo fresco).
   2. Inmediatamente agite la mezcla durante 10 s y se incuba a temperatura ambiente (TA) durante 10 min, antes de la adición de volumen de mezcla de transfección a los pocillos apropiados.
   3. Cubrir la placa, envuelva los lados con Parafilm, y centrifugar a 280 xg durante 5 minutos para ayudar a la transfección de células.
   4. Retire el Parafilm y luego colocar en la incubadora para cultivo a 37 ° C.
   5. Vuelva a colocar los medios de cultivo de 18 horas más tarde con DMEM completo fresco, y mantener en cultivo durante otras 72 horas.
   6. Opcional: 72 horas después de la transfección, las células transfectadas se pueden seleccionar mediante el cultivo en DMEM completo suplementado con 250 g / ml de geneticina, con el fin de obtener un transfectante estable policlonal.

3. La citometría de flujo ensayo basado en células para la detección de anticuerpos contra los antígenos de superficie neuronales

1. Separar HEK293 ^{NMDAR +,} HEK293 ^{D2R +,} y células HEK293 ^{de CTL} mediante incubación con 500 l / pocillo Versene durante aproximadamente 5 min a 37 ° C.
   1. Resuspender en 2ml/well de PBS (-Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +)} suplementado con FBS al 2% (PBS / FBS) y traslado a unas 15 ml o 50 ml tubo cónico.
   2. Lavar las células por centrifugación a 250 xg durante 6 min y resuspender el sedimento celular en 15-50 ml de PBS / FBS. Repita lavado 2x.
   3. Contar las células y luego volver a suspender en PBS / FBS al 1 x 10 ⁶ células / ml.
2. Diseño de la plantilla de 96 pocillos para la adquisición de citometría de flujo, teniendo en cuenta que ⁺ células HEK293 ^{D2R +} o HEK293 ^NMDAR, así como células HEK293 ^CTL tendrán que ser incubados con cada muestra de paciente o anticuerpo primario.
3. Se siembran las células en una placa de 96 pocillos de fondo en V a 50 000 células / nosotrosLL de acuerdo con la citometría de flujo plantilla de adquisición.
4. Sedimentar las células por centrifugación de la placa de 96 pocillos a 450 xg durante 5 min y suavemente eliminar el sobrenadante usando una pipeta multicanal electrónica o manual, inclinando la placa en un ángulo y teniendo cuidado de no aspirar el sedimento celular.
5. Incubar HEK293 ^{D2R +,} HEK293 ^{NMDAR +,} y células HEK293 ^CTL durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad con:
   1. Diluciones seriadas de anticuerpo primario con el fin de evaluar la expresión del antígeno de superficie.
   2. Las muestras de pacientes con el fin de detectar anticuerpos.
6. Utilice flujo apropiado citometría controles de compensación, por ejemplo. células HEK293 no transfectadas no teñidas, GFP ⁺ células HEK293 (AF647 ^-), y AF647 ⁺ células HEK293 no transfectadas (GFP).
7. Lavar las células por centrifugación a 450 xg durante 5 min y resuspender el sedimento de células en 170 l de PBS / FBS. Repita el paso de lavado dos veces más.
8. Se incuban las células durante 1 hr a TA en la oscuridad con una dilución 1:100 de anticuerpo secundario AF647-conjugado (IgG anti-humana para el suero del paciente y anti-IgG de ratón para el anti-NR1 o anti-D2R anticuerpos primarios).
9. Lavar las células tres veces, como en el paso 3.7, y volver a suspender en 35 l de PBS / FBS para citometría de flujo de células de adquisición.
10. Configure el muestreador de alto rendimiento (HTS) en el citómetro de flujo (BDLSRII).
11. Adquirir 10.000 eventos / pocillo de acuerdo con la citometría de flujo plantilla de adquisición.
12. Export y luego analizar los datos para el análisis utilizando una citometría de flujo paquete de software, tales como FlowJo v7.5:
    1. En primer lugar, puerta de las células HEK293 vivos basada en adelante (tamaño) y lateral (granularidad) dispersa.
    2. HEK293 células vivas Además de puerta basado en alta GFP-positividad para analizar sólo las células transfectadas.
    3. Determinar la intensidad de fluorescencia media (MFI) de la canal AF647 dentro de las células positivas para GFP en vivo.
    4. Exportar datos a Excel o Prism para el análisis:
       1. Terreno concentrations de anticuerpo primario (anti-NMDAR o anticuerpo anti-D2R) frente al IMF obtuvieron a partir de las células incubadas con estos anticuerpos.
       2. Para cada paciente y control de ejemplo, determinar el ΔMFI restando el MFI de las células HEK293 ^{de CTL} de la IMF de las células HEK293 ^{NMDAR + D2R +} HEK293 o, respectivamente.
       3. Calcule el umbral de positividad de anticuerpos mediante la adición de tres desviaciones estándar por encima de la ΔMFI media de la cohorte de control.
       4. Muestras individuales Parcela agrupan de acuerdo a su tipo de suero en un gráfico y representan el umbral como una línea.

Resultados

HEK293 células vivas ^{D2R +} y ^CTL HEK293 fueron adquiridas en el citómetro de flujo usando un muestreador de alto rendimiento. Durante el análisis, las células fueron cerrada sobre la base de dispersión frontal (tamaño) y los parámetros de dispersión lateral (granularidad) (Figuras 1A y 1D). Células HEK293 transfectadas expresan la molécula informadora, GFP, en el citoplasma, y las células no transfectadas fueron excluidos del análisis (Figuras 1...

Discusión

En este trabajo se describe una nueva aplicación de la citometría de flujo ensayo basado en células vivas para detectar anticuerpos dirigidos a proteínas neuronales específicas de la superficie celular usando un muestreador de alto rendimiento. Usando esta técnica, nos informan de que un subgrupo de pacientes afectados con enfermedades del SNC autoinmunes tienen anticuerpos séricos a aflorar a la superficie NMDAR o D2R.

Los pasos esenciales para la detección óptima de anticuerpos ut...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
pIRES2-EGFP vector	Clontech	6029-1
Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA	Missouri S&T cDNA Resource Centre	DRD020TN00
Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA			Gift from Prof A. Vincent  (Oxford, UK)
Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1)	BD Pharmingen	556308
Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11)	Sigma-Aldrich	WH0001813M1-50UG
Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L)	Invitrogen	A31571
Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L)	Invitrogen	A21445
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine and 110 mg/L sodium pyruvate	Invitrogen	11995-065
Foetal bovine serum	Invitrogen	10099-141
Gentamicin	Invitrogen	15710-072
GlutaMAX	Invitrogen	35050-061
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
Geneticin	Invitrogen	10131-035
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+)	Invitrogen	14190-144
TrypLE Express (1x) with Phenol Red	Invitrogen	12605-028
0.9% Sodium chloride	Baxter	AHF7975
Polyethylenimine	Polysciences Inc	9002-98-6
Versene	Invitrogen	15040-066
XhoI	Roche	10899194001
NheI	Roche	10885843001
PureLink PCR Purification Kit	Invitrogen	K3100-01
JetQuick Gel Extraction Spin Kit	Genomed	420050
T4 DNA Ligase	Roche	10481220001
Plasmid Plus Maxi Kit	Qiagen	12963
Name of Equipment/Software	Company	Catalog Number	Model/Version
Flow cytometer with high-throughput sampler system	BD Biosciences		BDLSRII with HTS
Inverted microscope	Olympus		CKX41 (with mercury lamp and U-RFLT50 power supply)
Electronic multichannel pipette (15-300 μl)	Eppendorf	613-2240P	12-channel Xplorer Plus
Excel	Microsoft		2010
Prism	GraphPad Software, Inc.		v4
FlowJo	Treestar		v7.5
50 ml polypropylene conical tubes	BD Biosciences	352070
6-well plate	BD Biosciences	353046
Tissue culture flask (T75)	BD Biosciences	353136
Parafilm	Pechiney Plastic Packaging	PM-992
V-bottom 96-well plate	Corning	651180