ハイスループットフローサイトメトリー細胞ベースのアッセイN-メチル-D-アスパラギン酸受容体またはヒト血清中のドーパ​​ミン-2受容体に対する抗体を検出する

要約

近年、生細胞ベースのアッセイは、表面とコンフォメーション抗原に対する抗体を検出するために首尾よく使用されている。ここでは、患者の大規模コホートの分析を可能にするフローサイトメトリーのハイスループット流を用いた方法を記載している。新規な抗体の検出は、免疫媒介性障害の診断および治療を改善する。

要約

近年、表面と神経伝達に関与コンフォメーションのタンパク質に対する抗体は、小児および成人における自己免疫CNS疾患で検出されている。これらの抗体は、診断および治療を導くために使用されてきた。細胞ベースのアッセイは、患者の血清中の抗体の検出を改善している。次いで、それらを蛍光標識二次抗体、続いて、希釈した患者血清と共にインキュベートし、真核細胞上の脳の抗原の表面発現に基づいている。洗浄後、二次抗体の結合を、フローサイトメトリーによって分析する。当社グループは、確実に特定の神経伝達物質受容体に対する抗体を検出するために、生きた細胞ベースのアッセイメトリーの高スループット·フローを開発しました。このフローサイトメトリー法が効率的で、単純で定量的であり、ハイスループットサンプラシステムの使用を容易に短期間でアッセイするために大きな患者コホートを可能にする。さらに、このようなセルベース回答が容易に中枢神経系及び末梢の両方から、多くの異なる抗原性標的に対する抗体を検出するように適合させることができる。追加の新規抗体のバイオマーカーを発見することは、迅速かつ正確な診断を可能にし、免疫介在性障害の治療を改善するであろう。

概要

近年、中枢神経系（CNS）自己免疫疾患の形態が同定されている。なお、これらの疾患が関連しており、自己抗体の存在によって定義されることが示されている。これらの抗体は、神経伝達^を1,2に関わる神経細胞の受容体やシナプスのタンパク質に結合する。異なる抗原は、例えば、N-メチル-D-アスパラギン酸受容体^{（NMDAR）3-5、γ-}アミノ酪酸B受容体（GABAの_B）受容体^6、α-アミノ-3 -ヒドロキシ-5 -メチル-4 -として、検出されたイソキサゾール酸（AMPA）受容体^7、電位依存性カリウムチャネル（VGKC）関連タンパク質：ロイシンリッチ神経膠活性化1タンパク質（LGL-1）およびコンタクチン関連タンパク質^{2（capsr2）8,9、}グルタミン酸受容体^5,10 、およびドーパミン2受容体^{（D2R）11。}過去には、（主に脳炎と呼ばれる）これらの自己免疫CNS障害は、多くの場合、診断未確定と未処理だった。これらの新規抗体のバイオマーカー、 例えばNMDAR抗体又はD2R抗体は実質的に診断や意識を改善しているし、患者のための治療の選択肢を開いている。実際、免疫療法による早期治療が改善された結果^11,12と関連している。

例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）およびウェスタンブロットなどの抗体を検出するための従来の方法は、血清中の抗体の検出のために使用されている。しかし、それらは容易に細胞外または表面エピトープの認識を有効にしないと、そうではなく、細胞内のエピトープに向けて免疫反応性を明らかにすることができる。さらに、神経伝達に関与する重要なタンパク質の細胞外ドメインに結合する抗体は、病原^2,3,7,13,14である可能性が高い。このため、患者の関連する細胞表面や細胞外抗体の標的を発見するための正確で高感度なアッセイの開発が最も重要です。フィールドのゴールドスタンダード法は、いわゆる「細胞のBAの生細胞の使用に基づいているSED検定」。この方法は、哺乳動物細胞、目的の抗原の完全なcDNA配列を含有するベクターのトランスフェクションによるその天然の形態で（最も頻繁にヒト胚性腎臓293（HEK293）細胞）の表面での抗原の発現を伴う。生きた非透過次いで、細胞を、希釈した患者血清と共にインキュベートし、蛍光色素結合抗ヒト免疫グロブリン（Ig）二次抗体が続く。蛍光の強度又はレベルが検出されると自己抗体結合のレベルに関連している。唯一の抗原が細胞内で過剰発現されているように、この技術は、特異的である。最も広く使用されている「読み出し^{」4,5,8-10を}免疫細胞化学の後、共焦点顕微鏡分析している。しかしながら、細胞ベースのアッセイ、フローサイトメトリーが正常に^15-17脱髄疾患を有する患者において抗体を検出するために使用されている。特に、ウォーターズらは^、15パンを用いた抗体の検出を比較し細胞ベースのアッセイを含む、抗体検出技術のエルは、顕微鏡検査またはフローサイトメトリーに続いて分析を流れ、そして最も敏感正確で、かつ信頼性の高い方法であることが、細胞ベースのアッセイフローサイトメトリーを示している。それは研究者に依存し、定量的ではなく、放射性物質のいずれかの使用を含まないように、したがって、細胞ベースのアッセイ、フローサイトメトリーが有利である。それが大きな患者コホートが短時間でアッセイすることを可能にするようにも便利です。

より最近では、我々は、CNS自己免疫疾患を有する患者において¹¹ NMDAR抗体及びD2R抗体を検出するための細胞ベースのアッセイフローサイトメトリーのハイスループットフローを最適化した。我々のグループは最近、細胞ベースのアッセイ、フローサイトメトリーを用いて、患者血清中のNMDAR抗体を検出した。これらのNMDAR抗体陽性血清は、以前は、共焦点顕微鏡を用いて分析し、また^、11陽性であった。このプロトコルは、Cの検出のための細胞ベースのアッセイ、フローサイトメトリーの概要を説明自動化されたハイスループットサンプラーを用いた患者血清中のonformationに敏感な中枢神経系の抗体。

プロトコル

1。たpIRES2-EGFPベクターのエンコーディングD2RまたはNMDARを構築するための戦略をサブクローニング

1. 人間D2RまたはNMDARサブユニット1（NR1）の完全長cDNAクローンを得る。
2. このように同時発現される抗原およびGFPの両方を可能にする高感度緑色蛍光タンパク質内部リボソーム侵入部位（IRES）の制御下で（GFP）レポーターを有する膜貫通タンパク質の発現に適しているたpIRES2-EGFPのような発現ベクターを選択する別途、細胞。
3. たpIRES2-EGFPベクター内のヒトcDNAをサブクローニング。
   1. のcDNAをサブクローニングするために、（例えば、人間のD2RのcDNAのためのNheIおよびXhoIのために）適切な制限酵素を使用しています。
   2. ライゲーションカットcDNAは、制限されたたpIRES2-EGFPベクター内に挿入します。
   3. 配列は、ベクターが正しい順序が含まれているかどうかを確認するたpIRES2-EGFP D2RまたはNMDARベクトルを連結した。
   4. トランスフェクション後の使用のためにたpIRES2-EGFP D2RまたはNMDARベクトルを浄化し、増幅する。

イトルを記入 "> 2。神経抗原の発現のためのHEK293細胞トランスフェクション

1. 4.5グラム/ LのD-グルコース、L-グルタミン及び110ミリグラムとの完全な新鮮ダルベッコ変法イーグル培地（1×）（DMEM）を用いて組織培養フラスコ中で培養HEK293細胞/ 10％ウシ胎児血清（FBS）を補充したLピルビン酸ナトリウム、 2 mMのグルタ、および50μg/ mlのゲンタマイシン。
2. コニカルチューブにトリプシンおよび転送を使用しているHEK293細胞を剥離。
   1. 6分間250×gで細胞を遠心分離して洗浄し、新鮮な完全DMEM中で細胞ペレットを再懸濁します。
3. インキュベーター内で37℃で2ミリリットルDMEM中で一晩約8×10 ⁵細胞/ウェルと文化、5％CO ₂で細胞や種子6ウェルプレートをカウントします。
4. それらは約70％コンフルエントに達したら、たpIRES2-EGFP NR1（HEK293 ^{NMDAR +}細胞）、たpIRES2-EGFP D2R（HEK293 ^{D2R +}細胞）を用いてHEK293細胞をトランスフェクトしたpIRES2-EGFP（HEK293 ^CTL細胞 、ベクター対照）を以下のように。後で補償のためのいくつかの非トランスフェクトしたHEK293細胞を保管してください。
   1. 2.5μgのDNAを、200μlの0.9％塩化ナトリウムおよび4μg/ mlのポリエチレン/ウェル（各2ミリリットルを含む新鮮な完全DMEM）を含むトランスフェクションミックスの必要なボリュームを準備します。
   2. 直ちに10秒間混合物をボルテックスし、適切なウェルにトランスフェクションミックスの体積を添加する前に、10分間室温（RT）でインキュベートする。
   3. 、プレートを覆いパラフィルムで両面をラップし、細胞トランスフェクションを支援するために5分間280×gで遠心する。
   4. パラフィルムを外し、37℃で培養するためのインキュベーター内に配置
   5. 新鮮な完全DMEMで18時間後に培養液を交換し、さらに72時間培養中に維持する。
   6. オプション：72時間トランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞は、ポリクローナル安定なトランスフェクタントを得るためには、250μg/ mlのジェネテシンを補充した完全DMEM中で培養することにより選択することができる。

3。神経表面抗原に対する抗体の検出のためのフローサイトメトリー細胞ベースのアッセイ

1. 37℃で約5分間、500μL/ウェルベルセンとのインキュベーションにより、HEK293 ^{NMDAR +、HEK293 D2R +、}およびHEK293 ^CTL細胞を剥離
   1. PBSの2ml/wellに再懸濁^（+ / - ^の Mg ^{2 +}のCa ^2）は 、2％のFBS（PBS / FBS）を補充し、15ミリリットルまたは50mlコニカルチューブに移す。
   2. 6分間250×gで遠心分離して細胞を洗浄し、15〜50ミリリットルのPBS / FBS中で細胞ペレットを再懸濁します。ウォッシュ2Xを繰り返します。
   3. 細胞を計数した後、1×10 ⁶細胞/ mlでPBS / FBS中に再懸濁する。
2. HEK293 ^{D2R +}又はHEK293 ^{NMDAR +}細胞、ならびに^CTL HEK293 ^細胞は、各患者試料又は一次抗体と共にインキュベートされなければならないことを考慮して、フローサイトメトリー取得のための96ウェルテンプレートをデザインする。
3. 50,000細胞/我々におけるV底96ウェルプレート中の種子細胞llの取得テンプレートフローサイトメトリーに記載の方法。
4. 5分間450×gで96ウェルプレートを遠心分離し、穏やかに電子的または手動のマルチチャンネルピペットを用いて上清を除去し、角板を傾斜し、細胞ペレットを吸引しないように注意を取ることにより細胞をペレット化。
5. と暗闇の中で、室温で1時間HEK293 ^{D2R +、HEK293 NMDAR +、}およびHEK293 ^CTL細胞をインキュベート。
   1. 抗原表面発現を評価するために、一次抗体の連続希釈。
   2. 抗体を検出するために、患者のサンプル。
6. 例えば 、補償コントロールサイトメトリ適切なフローを使用してください。染色されていない非トランスフェクトHEK293細胞に、GFP ⁺ HEK293細胞（AF647 ^{- ）、}および非トランスフェクトAF647 ⁺ HEK293細胞（GFP）。
7. 5分間450×gで遠心分離して細胞を洗浄し、170μlのPBS / FBS中で細胞ペレットを再懸濁します。反復洗浄工程をさらに2回。
8. 1時間細胞をインキュベート（抗NR1または抗D2R一次抗体のために、患者の血清および抗マウスIgG抗ヒトIgG）AF647結合二次抗体の1:100希釈した暗闇の中でRTでR。
9. ステップ3.7のように、細胞を3回洗浄し、細胞の取得、フローサイトメトリーのために35μlのPBS / FBS中で懸濁します。
10. （BDLSRII）フローサイトメーター上でハイスループットサンプラー（HTS）を設定します。
11. 取得テンプレートをフローサイトメトリーによると万イベント/ウェル獲得。
12. エクスポートして、このようなFlowJoソフトのV7.5などのソフトウェアパッケージ、フローサイトメトリーを用いた分析のためにデータを分析します。
    1. まず、前方（サイズ）および側方（粒度）に基づいてゲート生HEK293細胞が散乱する。
    2. 唯一のトランスフェクションされた細胞を分析するために、高GFP-陽性に基づいてさらにゲート生きたHEK293細胞。
    3. ライブGFP陽性細胞内AF647チャネルの平均蛍光強度（MFI）を決定します。
    4. 分析用のExcelやプリズムへのデータのエクスポート：
       1. プロットCMFIに対する一次抗体（抗NMDARまたは抗D2R抗体）のoncentrationsは、これらの抗体と共にインキュベートした細胞から得られた。
       2. 各患者と対照サンプルについては、それぞれHEK293 ^{D2R +}またはHEK293 ^{NMDAR +}細胞のMFIからHEK293 ^のCTL細胞のMFIを差し引くことによりΔMFIを決定します。
       3. 対照コホートの平均ΔMFI上記の3つの標準偏差を追加することにより、抗体陽性のしきい値を計算します。
       4. グラフ上にそれらの血清型に従ってグループ化された個々のサンプルをプロットし、線としてしきい値を表しています。

結果

生きHEK293 ^{D2R +}とHEK293 ^CTL細胞は、高スループットサンプラーを使用して、フローサイトメーターで得た。分析の間、細胞は、前方散乱（大きさ）および側方散乱（粒度）パラメータ（ 図1Aおよび1D）に基づいてゲートした。トランスフェクトされたHEK293細胞は、細胞質において、レポーター分子、GFPを発現し、そして非トランスフェクト細胞を、分析?...

ディスカッション

本論文では、高スループットのサンプラーを使用して、特定の細胞表面の神経タンパク質を標的とする抗体を検出するために、生きた細胞ベースのアッセイ、フローサイトメトリーの新しいアプリケーションを記述します。この技術を用いて、自己免疫CNS疾患に罹患した患者のサブグループは、NMDARの表面又はD2Rに表面血清抗体を有することを報告している。

生細胞ベー...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
pIRES2-EGFP vector	Clontech	6029-1
Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA	Missouri S&T cDNA Resource Centre	DRD020TN00
Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA			Gift from Prof A. Vincent  (Oxford, UK)
Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1)	BD Pharmingen	556308
Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11)	Sigma-Aldrich	WH0001813M1-50UG
Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L)	Invitrogen	A31571
Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L)	Invitrogen	A21445
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine and 110 mg/L sodium pyruvate	Invitrogen	11995-065
Foetal bovine serum	Invitrogen	10099-141
Gentamicin	Invitrogen	15710-072
GlutaMAX	Invitrogen	35050-061
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
Geneticin	Invitrogen	10131-035
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+)	Invitrogen	14190-144
TrypLE Express (1x) with Phenol Red	Invitrogen	12605-028
0.9% Sodium chloride	Baxter	AHF7975
Polyethylenimine	Polysciences Inc	9002-98-6
Versene	Invitrogen	15040-066
XhoI	Roche	10899194001
NheI	Roche	10885843001
PureLink PCR Purification Kit	Invitrogen	K3100-01
JetQuick Gel Extraction Spin Kit	Genomed	420050
T4 DNA Ligase	Roche	10481220001
Plasmid Plus Maxi Kit	Qiagen	12963
Name of Equipment/Software	Company	Catalog Number	Model/Version
Flow cytometer with high-throughput sampler system	BD Biosciences		BDLSRII with HTS
Inverted microscope	Olympus		CKX41 (with mercury lamp and U-RFLT50 power supply)
Electronic multichannel pipette (15-300 μl)	Eppendorf	613-2240P	12-channel Xplorer Plus
Excel	Microsoft		2010
Prism	GraphPad Software, Inc.		v4
FlowJo	Treestar		v7.5
50 ml polypropylene conical tubes	BD Biosciences	352070
6-well plate	BD Biosciences	353046
Tissue culture flask (T75)	BD Biosciences	353136
Parafilm	Pechiney Plastic Packaging	PM-992
V-bottom 96-well plate	Corning	651180