Haut-débit cytométrie en flux test cellulaire pour détecter les anticorps de la N-méthyl-D-aspartate Receptor ou récepteur de la dopamine-2 dans le sérum humain

Résumé

Au cours des dernières années, des essais à base de cellules vivantes ont été utilisées avec succès pour détecter des anticorps contre les antigènes de surface et de conformation. Ici, nous décrivons une méthode utilisant un écoulement à haut débit cytométrie permettant l'analyse de grandes cohortes de patients. Détection de nouveaux anticorps permettra d'améliorer le diagnostic et le traitement des troubles du système immunitaire à médiation.

Résumé

Au cours des dernières années, des anticorps contre les protéines de surface et conformationnels impliqués dans la neurotransmission ont été détectés dans les maladies auto-immunes du système nerveux central chez les enfants et les adultes. Ces anticorps ont été utilisés pour orienter le diagnostic et le traitement. Essais cellulaires ont amélioré la détection des anticorps dans le sérum du patient. Ils sont basés sur l'expression des antigènes de surface du cerveau sur les cellules eucaryotes, qui sont ensuite incubées avec des sérums dilués de patients suivis par des anticorps secondaires conjugués à un fluorochrome. Après lavage, un anticorps secondaire de liaison est ensuite analysée par cytométrie en flux. Notre groupe a développé un flux à haut débit cytométrie dosage à base de cellules-live pour détecter de manière fiable les anticorps contre les récepteurs de neurotransmetteurs spécifiques. Cette méthode de cytométrie en flux est simple, quantitative, efficace, et l'utilisation d'un système d'échantillonnage à haut débit permet de grandes cohortes de patients pour être facilement analysés dans un court espace de temps. En outre, ce repose-cellule commedire peut être facilement adapté pour détecter les anticorps à de nombreuses cibles antigéniques différents, à la fois du système nerveux central et de la périphérie. Découvrir d'autres biomarqueurs d'anticorps roman permettra un diagnostic rapide et précis et améliorer le traitement de troubles à médiation immunitaire.

Introduction

Au cours des dernières années, des formes auto-immunes du système nerveux central (SNC) des maladies ont été identifiés. Il a été montré que ces maladies sont associées et définies par la présence d'auto-anticorps. Ces anticorps se lient à des récepteurs ou des protéines synaptiques des neurones impliqués dans la neurotransmission ^1,2. Différents antigènes ont été détectés, tels que des récepteurs N-méthyl-D-aspartate (NMDAR) ^3-5, récepteur de la γ-aminobutyrique B (GABA _B) récepteur ^6, α-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4- acide isoxazolepropionique (AMPA) ^7, le canal potassique voltage-dépendants (VGKC) protéines associées: riche en leucine gliome activé une protéine (LGL-1) et contactine-associated protein 2 (capsr2) récepteur ^{8,9, 5,10} glutamate , et de la dopamine-2 récepteur (D2R) ^11. Dans le passé, ces troubles du SNC auto-immunes (principalement appelé encéphalite) étaient souvent non diagnostiquée et non traitée. Ces nouveaux biomarqueurs d'anticorps, par exemple,anticorps NMDAR ou anticorps D2R, ont considérablement amélioré le diagnostic et la sensibilisation, et ont ouvert des options de traitement pour les patients. En effet, un traitement précoce avec des immunothérapies est associée à une amélioration des résultats ^11,12.

Les méthodes traditionnelles de détection des anticorps, tels que des immuno-essai enzymatique (ELISA) et Western blot ont été utilisées pour la détection des anticorps dans le sérum. Toutefois, ils ne permettent pas facilement la reconnaissance d'épitopes extracellulaires ou de surface et, plutôt, peuvent révéler immunoréactivité contre un épitope intracellulaire. En outre, des anticorps qui se lient au domaine extracellulaire des protéines importantes impliquées dans la neurotransmission sont susceptibles d'être ^2,3,7,13,14 pathogène. Par conséquent, le développement de dosages précis et sensibles à découvrir la surface de la cellule pertinente ou des cibles d'anticorps chez les patients extracellulaire est primordiale. La méthode de l'étalon d'or dans le domaine est basée sur l'utilisation de cellules vivantes, dans ce qu'on appelle "cellule-baessais sed ". Ce procédé implique l'expression d'un antigène à la surface des cellules de mammifères (le plus souvent du rein 293 (HEK 293) de cellules embryonnaires humaines) dans sa forme native, par transfection de vecteurs contenant la séquence complète de l'ADNc de l'antigène d'intérêt. Les cellules non perméabilisés vivants sont ensuite incubées avec du sérum de patient dilué et suivies par un fluorochrome conjugué anti-immunoglobuline humaine (Ig), un anticorps secondaire. L'intensité ou le niveau de fluorescence est alors détectée et est associée au niveau de la liaison auto-anticorps. Cette technique est spécifique, comme un seul antigène est surexprimé dans les cellules. Le plus utilisé "lecture" a été analyse par microscopie confocale après immunocytochimie ^4,5,8-10. Cependant, la cytométrie en flux tests cellulaires ont été utilisés avec succès pour détecter les anticorps chez les patients atteints de maladies démyélinisantes ^15-17. En particulier, Waters et al. ¹⁵ ont comparé la détection des anticorps en utilisant une casseroleel des techniques de détection des anticorps, y compris des analyses cellulaires suivies par microscopie ou des analyses de flux cytométrie, et a montré la cytométrie en flux essai à base de cellules pour être la méthode la plus sensible, précis et fiable. Par conséquent, la cytométrie en flux essai à base de cellules est avantageuse car elle est quantitative, pas enquêteur dépendant, et n'implique pas l'utilisation de matières radioactives. Il est également commode, car il permet de grandes cohortes de patients à tester dans un court laps de temps.

Plus récemment, nous avons optimisé un flux à haut débit cytométrie test cellulaire pour détecter les anticorps dirigés NMDAR et anticorps D2R chez les patients atteints de maladies auto-immunes du système nerveux central ^11. Notre groupe a récemment détecté des anticorps NMDAR dans les sérums des patients en utilisant la cytométrie en flux essai à base de cellules. Ces sérums d'anticorps positif NMDAR ont été préalablement analysés par microscopie confocale et ont également révélé positif ^11. Ce protocole décrit un dosage de cytométrie de flux à base de cellules pour la détection de canticorps CNS onformation sensible dans le sérum du patient en utilisant un échantillonneur à haut débit automatisé.

Protocole

Une. Sous-clonage Stratégie de construire pIRES2-EGFP vecteur codant D2R ou NMDAR

1. Obtenir ADNc complet clone de D2R humaine ou NMDAR sous-unité 1 (RN1).
2. Choisir un vecteur d'expression, tel que pIRES2-EGFP, ce qui est approprié pour l'expression de protéines transmembranaires avec une protéine améliorée verte fluorescente (GFP) rapporteur sous le contrôle d'un site interne d'entrée du ribosome (IRES), permettant à la fois des antigènes et des GFP d'être co-exprimées dans cellules séparément.
3. Sous-cloner l'ADNc humain dans pIRES2-EGFP vecteur.
   1. Pour sous-cloner l'ADNc, en utilisant les enzymes de restriction appropriées (par exemple Nhel et Xhol pour D2R ADNc humain).
   2. ADNc Ligate coupe insérer dans restreint vecteur pIRES2-EGFP.
   3. Séquence ligaturé pIRES2-EGFP D2R ou NMDAR vecteur de vérifier si le vecteur contient la séquence correcte.
   4. Purifier et amplifier pIRES2-EGFP D2R ou NMDAR vecteur pour une utilisation ultérieure dans la transfection.

itre "> 2. HEK293 Transfection cellulaire pour l'expression de l'antigène neuronale

1. Les cellules de la culture HEK293 en flacons de culture tissulaire avec un milieu de Eagle modifié frais Dulbecco (1x) (DMEM) avec 4,5 g / L de D-glucose, L-glutamine et de 110 mg / L de pyruvate de sodium supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 2 mM GlutaMAX, et 50 ug / ml de gentamicine.
2. Détacher les cellules HEK293 en utilisant la trypsine et la transférer dans un tube conique.
   1. Laver les cellules par centrifugation à 250 g pendant 6 min et remettre en suspension le culot cellulaire dans du DMEM complet frais.
3. Compter les cellules et les semences plaques de 6 puits à environ 8 x 10 ⁵ cellules / puits et de la culture pendant une nuit dans du DMEM 2 ml à 37 ° C et 5% de CO ₂ dans un incubateur.
4. Une fois qu'ils ont atteint environ 70% de confluence, transfecter les cellules HEK293 avec pIRES2-EGFP NR1 (HEK293 ^NMDAR Les cellules ^+), pIRES2-EGFP D2R (HEK293 ^{D2R +} cellules), et (cellules HEK293 ^CTL; contrôle vectoriel) pIRES2-EGFP comme suit.Gardez quelques cellules HEK293 non transfectées d'indemnisation plus tard.
   1. Préparer un volume déterminé de mélange de transfection comprenant 2,5 ug d'ADN, de 200 ul de chlorure de sodium à 0,9% et de 4 ug / ml de polyéthylèneimine / puits (contenant chacune 2 ml de DMEM complet frais).
   2. Vortex immédiatement le mélange pendant 10 secondes et incuber à température ambiante (RT) pendant 10 min, avant d'ajouter le volume de mélange de transfection dans les puits appropriés.
   3. Recouvrir la plaque, envelopper les côtés avec du Parafilm et centrifuger à 280 g pendant 5 min à l'aide transfection cellulaire.
   4. Retirez le Parafilm et les placer dans l'incubateur de culture à 37 ° C.
   5. Remplacez le support de culture 18 heures plus tard avec du DMEM complet frais, et maintenir dans la culture pour un autre 72 heures.
   6. Facultatif: 72 heures après la transfection, les cellules transfectées peuvent être sélectionnées par culture dans du DMEM complet additionné de 250 ug / ml de généticine, de manière à obtenir un transfectant stable polyclonal.

3. Cytométrie en flux test cellulaire pour la détection des anticorps dirigés contre les antigènes de surface de neurones

1. Détacher HEK293 ^{NMDAR +,} HEK293 ^{D2R +,} et les cellules HEK293 ^CTL par incubation avec 500 ul / puits Versene pendant environ 5 min à 37 ° C.
   1. Remettre en suspension dans du PBS 2ml/well (-Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +-)} supplémenté avec 2% de FBS (PBS / FBS) et transférer dans un 15 ml ou 50 ml de tube conique.
   2. Laver les cellules par centrifugation à 250 g pendant 6 min et remettre en suspension le culot cellulaire dans 15 à 50 ml de PBS / FBS. Répétez lavage 2x.
   3. Compter les cellules et remettre en suspension dans du PBS / FBS à 1 x 10 ⁶ cellules / ml.
2. Concevoir le modèle à 96 puits pour l'acquisition de la cytométrie en flux, en considérant que HEK293 ^{D2R + +} ou des cellules HEK293 ^NMDAR, ainsi que des cellules HEK293 ^CTL devront être incubé avec chaque échantillon de patient ou de l'anticorps primaire.
3. cellules de semences dans une plaque de 96 puits à fond en V à 50 000 cellules / nousll en fonction de la cytométrie de flux modèle d'acquisition.
4. Pellet les cellules par centrifugation de la plaque de 96 puits à 450 g pendant 5 min et retirez délicatement le surnageant à l'aide d'une pipette multicanaux électronique ou manuel, en inclinant la plaque sur un angle et en prenant soin de ne pas aspirer le culot cellulaire.
5. Incuber HEK293 ^{D2R +,} HEK293 ^{NMDAR +} et les cellules HEK293 ^CTL pour 1 heure à température ambiante dans l'obscurité avec:
   1. Des dilutions en série d'anticorps primaire afin d'évaluer l'expression des antigènes de surface.
   2. Les échantillons de patients afin de détecter des anticorps.
6. Utilisez flux approprié cytométrie contrôles de compensation, par exemple. les cellules HEK293 non transfectées non colorées, GFP ⁺ des cellules HEK293 (AF647 ^-), et non transfectées AF647 ⁺ cellules HEK293 (GFP).
7. Laver les cellules par centrifugation à 450 xg pendant 5 min et remettre en suspension le culot cellulaire dans 170 pi de PBS / FBS. Répétez l'étape de lavage deux fois de plus.
8. Incuber les cellules pendant 1 hr à température ambiante dans l'obscurité avec une dilution 1:100 d'anticorps secondaire conjugué à AF647 (anti-IgG humaine dans le sérum du patient et de l'anti-IgG de souris pour des anticorps primaires anti-NR1 ou anti-D2R).
9. Laver les cellules trois fois, comme dans l'étape 3.7, et remettre en suspension dans 35 ul de PBS / FBS à cytométrie de flux des cellules acquisition.
10. Mettre en place le haut débit échantillonneur (HTS) sur le cytomètre de flux (BDLSRII).
11. Acquérir 10 000 événements / puits selon la cytométrie de flux modèle d'acquisition.
12. Exporter, puis analyser les données pour l'analyse en utilisant une cytométrie de flux logiciel, comme FlowJo v7.5:
    1. Premièrement, porte les cellules vivantes HEK293 basé sur l'avant (taille) et le côté (granularité) disperse.
    2. En outre grille des cellules HEK293 en direct sur la base de haute GFP-positivité pour analyser seulement les cellules transfectées.
    3. Déterminer l'intensité moyenne de fluorescence (MFI) du canal AF647 dans les cellules GFP-positives vivants.
    4. Exporter des données dans Excel ou prisme d'analyse:
       1. Terrain concentrations d'anticorps primaire (anti-NMDAR ou un anticorps anti-D2R) par rapport à la MFI obtenues à partir des cellules incubées avec ces anticorps.
       2. Pour chaque échantillon de patient et contrôle, déterminer la ΔMFI en soustrayant le MFI des cellules HEK293 ^CTL de l'IMF de la HEK293 ^{D2R +} ou HEK293 ^NMDAR cellules ^+, respectivement.
       3. Calcul du seuil de positivité des anticorps par ajout de trois écarts-types au-dessus de la ΔMFI moyen de la cohorte témoin.
       4. échantillons individuels de parcelles regroupées en fonction de leur type de sérum sur un graphique et représentent le seuil en ligne.

Résultats

Cellules HEK293 vivre ^{D2R +} et HEK293 ^CTL ont été acquises à la cytométrie en flux en utilisant un échantillonneur à grand débit. Lors de l'analyse, les cellules ont été déclenchés en fonction de diffusion vers l'avant (de taille) et diffusion latérale (granularité) paramètres (Figures 1A et 1D). Des cellules HEK293 transfectées ont exprimé la molécule rapporteur, la GFP, dans le cytoplasme, et les cellules non transfectées ont été exclu...

Discussion

Cet article décrit une nouvelle application de la cytométrie de flux essai à base de cellules en direct pour détecter les anticorps ciblant les protéines spécifiques de neurones de la surface de la cellule à l'aide d'un échantillonneur à haut débit. Grâce à cette technique, nous signaler qu'un sous-groupe de patients atteints de maladies auto-immunes du système nerveux central ont des anticorps sériques à la surface ou à la surface NMDAR D2R.

Les étapes essentiel...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
pIRES2-EGFP vector	Clontech	6029-1
Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA	Missouri S&T cDNA Resource Centre	DRD020TN00
Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA			Gift from Prof A. Vincent  (Oxford, UK)
Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1)	BD Pharmingen	556308
Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11)	Sigma-Aldrich	WH0001813M1-50UG
Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L)	Invitrogen	A31571
Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L)	Invitrogen	A21445
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine and 110 mg/L sodium pyruvate	Invitrogen	11995-065
Foetal bovine serum	Invitrogen	10099-141
Gentamicin	Invitrogen	15710-072
GlutaMAX	Invitrogen	35050-061
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
Geneticin	Invitrogen	10131-035
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+)	Invitrogen	14190-144
TrypLE Express (1x) with Phenol Red	Invitrogen	12605-028
0.9% Sodium chloride	Baxter	AHF7975
Polyethylenimine	Polysciences Inc	9002-98-6
Versene	Invitrogen	15040-066
XhoI	Roche	10899194001
NheI	Roche	10885843001
PureLink PCR Purification Kit	Invitrogen	K3100-01
JetQuick Gel Extraction Spin Kit	Genomed	420050
T4 DNA Ligase	Roche	10481220001
Plasmid Plus Maxi Kit	Qiagen	12963
Name of Equipment/Software	Company	Catalog Number	Model/Version
Flow cytometer with high-throughput sampler system	BD Biosciences		BDLSRII with HTS
Inverted microscope	Olympus		CKX41 (with mercury lamp and U-RFLT50 power supply)
Electronic multichannel pipette (15-300 μl)	Eppendorf	613-2240P	12-channel Xplorer Plus
Excel	Microsoft		2010
Prism	GraphPad Software, Inc.		v4
FlowJo	Treestar		v7.5
50 ml polypropylene conical tubes	BD Biosciences	352070
6-well plate	BD Biosciences	353046
Tissue culture flask (T75)	BD Biosciences	353136
Parafilm	Pechiney Plastic Packaging	PM-992
V-bottom 96-well plate	Corning	651180