İnsan Serum içinde N-metil-D-aspartat reseptör ya da dopamin-2 reseptör antikorları algılamak üzere yüksek verimli Flow Cytometry hücre bazlı bir deneyde

Özet

Son yıllarda, canlı hücre bazlı deneyler, yüzey ve şekilsel antijenlere karşı antikorlar tespit etmek için başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Burada, hastaların büyük kuşaklarının analiz sağlayarak sitometri yüksek verimli akışını kullanarak bir yöntem açıklanmaktadır. Yeni antikorların tespiti immün aracılı bozuklukların tanı ve tedavi artıracaktır.

Özet

Son yıllarda, yüzey ve sinir iletimi ile ilgili yapısal proteinlerine karşı olan antikorlar, çocuklar ve yetişkinler için CNS otoimmün hastalıklarda tespit edilmiştir. Bu antikorlar tanı ve tedaviye yol kullanılmıştır. Hücre bazlı deneyler hasta serum içinde antikorların saptanmasını iyileştirilmiştir. Daha sonra florokrom-konjuge sekonder antikor ile, ardından seyreltilmiş hasta serası ile inkübe edilir, ökaryotik hücreler üzerinde beyin antijenlerin, yüzey ekspresyonu dayanmaktadır. Yıkama işleminden sonra, bağlayıcı ikinci antikor daha sonra akış sitometrisi ile analiz edilir. Bizim grup güvenilir bir şekilde belirli bir nörotransmiter reseptörlerine karşı antikorlar tespit etmek için, canlı hücre bazlı bir deneyde sitometri yüksek verimli bir akış geliştirmiştir. Bu akış sitometri yöntemi yalındır, kantitatif, verimli ve geniş hasta kohortlarının kolayca zaman kısa bir alanda test edilmesi için yüksek verimli bir örnekleyici sistemi kullanma imkanı sağlar. Ayrıca, bu gibi hücre bazlıki kolayca merkezi sinir sistemi ve çevre hem de birçok farklı antijenik hedeflere antikorları tespit etmek için adapte edilebilir. Ilave yeni antikor biomarkerlerin Keşfi hızlı ve doğru tanı sağlamak ve bağışıklık aracılı bozuklukların tedavisini artıracaktır.

Giriş

Son yıllarda, merkezi sinir sistemi (CNS) hastalıkları ve oto-bağışıklık biçimleri tanımlanmıştır. Bu hastalıklar ve ilişkili otoantikorlann mevcudiyeti ile tanımlanır olduğu gösterilmiştir. Bu antikorlar ya da reseptörleri nöronal sinir iletimini ^1,2 dahil sinaptik proteinlere bağlanır. Farklı antijenler, örneğin N-metil-D-aspartat reseptör (NMDAR) ^3-5, γ-aminobütirik asit reseptör B (GABA _B) ⁶ reseptörü, α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-olarak tespit edilmiştir izoksazolepropiyonik asit (AMPA) reseptörü ^7, voltaj kapılı potasyum kanal (VGKC) bağlı proteinler: lösin açısından zengin glioma-aktive protein 1 (LGL-1) ve kontaktin-ilişkili protein 2 (capsr2) ^8,9, glutamat reseptörü ^5,10 ve dopamin-2 reseptörü (D2R) ^11. Geçmişte, (çoğunlukla ensefalit olarak da bilinir), bu otoimmün CNS bozuklukları sıklıkla teşhis ve tedavi edilmemiştir. Bu yeni biyolojik antikor, örnNMDAR antikor veya D2R antikor, esasen tanı ve farkındalık düzeldi, ve hastalar için tedavi seçenekleri açtı. Gerçekten de, bağışıklık ile erken tedavi geliştirilmiş sonuç ^11,12 ile ilişkilidir.

, Örneğin enzim bağlantılı immünosorbent deneyi (ELISA) ve western blot gibi antikorları tespit etmek için geleneksel yöntemler serumunda antikorların saptanması için kullanılmıştır. Ancak, hali hazırda hücre-dışı ya da yüzey epitoplarının tanınması olanak değildir ve, bunun yerine, bir hücre içi epitopuna karşı immunoreaktivitesini ortaya çıkarabilir. Ayrıca, sinir katılan önemli proteinlerin hücre dışı alanına bağlanan antikorlar, patojenik ^2,3,7,13,14 olması muhtemeldir. Bu nedenle, ilgili hücre yüzey ya da hücre-dışı hastalarda antikor hedefleri keşfetmek için doğru ve hassas analizlerin geliştirilmesi önemlidir. Alanındaki altın standart yöntem olarak adlandırılan, "hücre-ba olarak, canlı hücrelerin kullanımına dayanmaktadırsed deneyleri ". Bu yöntem, memeli hücrelerinin ilgilenilen antijenin tam cDNA dizisini ihtiva eden vektörler transfeksiyonu ile kendi doğal biçiminde (en çok insan embriyonik böbrek 293 (HEK293) hücre) yüzeyinde bir antijenin ekspresyonunu içerir. Geçirgen hale getirilmemiş canlı hücreler daha sonra, seyreltilmiş hasta serumu ile inkübe edildi ve florokrom-eşlenik anti-insan immünoglobülin (Ig) sekonder antikoru ile takip edilmektedir. Floresans yoğunluğu veya seviyesi, daha sonra tespit edilir ve bağlayıcı otoantikor seviyesine ilişkilidir. Tek bir antijen hücrelerinde aşırı eksprese olduğu gibi bu teknik, özgüdür. En çok "Okuması" kullanılmış immünsitokimya ^4,5,8-10 sonra konfokal mikroskopi analizi olmuştur. Bununla birlikte, hücre bazlı deneylerde akış sitometrisi başarılı demiyelinizan hastalıklar ^15-17 olan hastalarda antikorları tespit etmek için kullanılmıştır. Özellikle, Waters vd. ^15, bir tava ile bir antikorun saptanmasını karşılaştırıldığındaHücre bazlı mikroskobu ile takip deneylerinde ya da dahil olmak üzere, akış antikor algılama teknikleri el sitometri analizleri ve en hassas, doğru ve güvenilir bir yöntem olarak hücre bazlı bir deneyde akış sitometrisi göstermiştir. Bu araştırmacı bağımlı, kantitatif değildir ve radyoaktif malzemenin herhangi bir şekilde kullanılması anlamına gelmez Bu nedenle, hücre bazlı bir deneyde sitometri akışı avantajlıdır. Bu büyük hasta tabur kısa bir miktarda tahlil edilecek verir gibi de uygundur.

Daha yakın zamanlarda, otoimmun CNS hastalıkları olan hastalarda ¹¹ NMDAR antikor ve D2R antikoru belirlemek için hücre bazlı bir deneyde sitometri yüksek verimli bir akış optimize ettik. Bizim grubu son hücre bazlı bir deneyde akış sitometrisi kullanılarak hasta serumunda NMDAR antikor tespit edildi. Bu NMDAR antikoru pozitif serumlar daha önce konfokal mikroskopi kullanılarak analiz edildi ve ¹¹ pozitif olduğu bulunmuştur. Bu protokol, c tespiti için hücre bazlı bir deneyde bir akış sitometri özetlenmektedirotomatik yüksek verimli örneği kullanan hasta serumunda onformation duyarlı CNS antikor.

Protokol

1.. Strateji pIRES2-EGFP Vektör Kodlama D2R veya NMDAR Construct altklonlamıştır

1. İnsan D2R veya NMDAR alt biriminin 1 (NR1) tam uzunluktaki cDNA klonunu elde edilir.
2. Böyle bir durumda birlikte tanımlanması antijenleri ve GFP hem de mümkün kılan bir gelişmiş yeşil floresan protein, bir iç ribozom giriş sahası (IRES) kontrolü altında (GFP) raportör ile transmembran proteinlerin ekspresyonu için uygun olan pIRES2-EGFP gibi bir ifade vektörü, seç ayrı ayrı hücreler.
3. PIRES2-EGFP vektörü içinde insan cDNA alt-klonlanmıştır.
   1. , CDNA alt klonlamak, uygun kısıtlama enzimleri kullanmak için (insan D2R cDNA örneğin Nhel ve Xhol için).
   2. Ligatı kesilmiş cDNA kısıtlı pIRES2-EGFP vektörü içinde yerleştirin.
   3. Dizisi vektör doğru sırasını içerip içermediğini kontrol etmek pIRES2-EGFP D2R veya NMDAR vektörü bağlandı.
   4. Arındırmak ve transfeksiyon daha sonra kullanmak için pIRES2-EGFP D2R veya NMDAR vektörün yükseltilmesi.

itle "> 2. Nöronal Antijen İfade için HEK293 HÜCRE NAKLİ

1. Taze Dulbecco Modified Eagle Medium (1x) (DMEM) 4.5 g / L D-glikoz, L-glutamin ve 110 mg,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş / L sodyum piruvat ile birlikte ile doku kültürü şişelerinde Kültür HEK293 hücreleri, 2 mM GlutaMAX ve 50 ug / ml Gentamisin.
2. Tripsin ve transferi bir konik tüp kullanılarak HEK293 hücreleri ayırın.
   1. 6 dakika boyunca 250 xg'de hücreler santrifüj ile yıkayın ve taze bitmiş DMEM içinde bir hücre pelletini.
3. Yaklaşık 8 x 10 ⁵ hücre / göz ve kültür, gece boyunca 2 ml DMEM içinde 37 ° C de ve% 5, bir kuluçka makinesi içinde _CO2 de hücreleri ve tohum 6 kuyucuğu sayılır.
4. Bu yaklaşık% 70 ortak akışkanlığa eriştiklerinde sonra, pIRES2-EGFP NR1 (HEK293 ^{NMDAR +} hücreleri), pIRES2-EGFP D2R (HEK293 ^{D2R +} hücreleri) ile HEK293 hücreleri transfekte etmek, ve pIRES2-EGFP (HEK293 ^CTL hücreleri vektör kontrolü) aşağıdaki gibi.Sonra tazminat için bazı untransfected HEK293 hücreleri tutun.
   1. 2.5 ug DNA, 200 ul% 0.9 sodyum klorür ve 4 ug / ml polietilenimin / oyuk (her biri 2 ml taze tam DMEM içeren) içeren bir transfeksiyon karışımı gerekli hacmi hazırlayın.
   2. Hemen 10 saniye boyunca girdap karışımı ve uygun oyuklara transfeksiyon karışımı hacmi ilave edilmeden önce, 10 dakika süre ile oda sıcaklığında (RT) enkübe edilir.
   3. , Kapak plakası Parafilm ile yanlarını doğal olarak kaplayan ve hücre transfeksiyonu yardımcı olmak için 5 dakika boyunca 280 x g 'de santrifüj.
   4. Parafilm çıkarın ve sonra 37 ° C de kültüre inkübatöre koyun
   5. Taze tam DMEM ile 18 saat sonra kültür ortamı değiştirin ve başka bir 72 saat boyunca kültür korumak.
   6. İsteğe bağlı: 72 saat post-transfeksiyon, transfekte edilmiş hücreler, poliklonal stabil transfektan elde etmek amacıyla, 250 ug / ml Genetisin ile desteklenmiş tam DMEM içinde kültür tarafından seçilebilir.

3. Nöronal Antijenleri Yüzey antikor tespiti için Cytometry hücre bazlı bir deneyde Akış

1. 37 ° C'de yaklaşık 5 dakika boyunca 500 ul / well Versene ile kuluçkaya yatırılması ile HEK293 ^{NMDAR +,} HEK293 ^{D2R +} ve HEK293 hücreleri ^CTL ayırın
   1. PBS içinde süspanse 2ml/well (= Ca ^{2 +} / ^{Mg2 +)%} 2 FBS (PBS / FBS) ve 15 ml veya 50 ml konik bir tüp transfer ile takviye edilmiştir.
   2. 6 dakika boyunca 250 xg'de santrifüj ile hücreler yıkanır ve 15-50 ml PBS / FBS hücre pelletini. Yıkama 2x tekrarlayın.
   3. Hücre sayımı ve daha sonra 1 x 10 ⁶ hücre / ml 'de PBS / FBS içerisinde yeniden süspanse edin.
2. HEK293 ^{D2R +} veya HEK293 ^{NMDAR +} hücreleri, hem de ^CTL HEK293 hücreleri, her bir hasta numune ya da birincil antikor ile inkübe edilmesi olacağı dikkate alınarak, akış sitometri elde edilmesi için 96-çukurlu bir şablon tasarımı.
3. 50,000 hücre / biz bir V-tabanlı 96 oyuklu bir plaka içerisinde tohum hücrelerill alıcı şablon sitometri akışına göre.
4. 5 dakika boyunca 450 x g 'de 96-yuvalı plaka santrifüj ve nazikçe bir elektronik çok kanallı pipet ya da elle kullanarak süpernatan, bir açı ile plaka eğme ve hücre pelletini aspire dikkat alarak Pelet hücreleri.
5. HEK293 ^{D2R +,} HEK293 ^{NMDAR +} ve karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilmiş HEK293 hücreleri ^CTL:
   1. Yüzey antijen ekspresyonunu değerlendirmek için birincil antikorunun seri dilüsyonları.
   2. Antikoru belirlemek amacıyla hasta örnekleri.
6. Örneğin, tazminat kontrolleri sitometri uygun akışı kullanın. boyanmamış transfekte edilmemiş HEK293 hücreleri, GFP ⁺ HEK293 hücreleri (AF647 ^-) ve transfekte edilmemiş AF647 ⁺ HEK293 hücreleri (GFP).
7. 5 dakika boyunca 450 x g santrifüj ile hücreler yıkanır ve 170 ul PBS / FBS hücre pelletini. Yıkama adımı iki kez daha tekrarlayın.
8. 1 saat boyunca inkübe hücreleri(anti-NR1 ya da anti-D2R primer antikorlar hasta serum ve anti-fare IgG anti-insan IgG) AF647-konjuge sekonder antikor 1:100 seyreltme ile karanlıkta, oda sıcaklığında r.
9. Adım 3.7 'de olduğu gibi, hücreler üç kez yıkayın ve hücre devir akış sitometrisi için 35 ul PBS / FBS içerisinde yeniden süspanse edin.
10. (BDLSRII) sitometresi akış yüksek verim sampler (HTS) ayarlayın.
11. Edinimi şablonun sitometri akışına göre 10.000 olaylar / kuyu edinin.
12. İhracat ve sonra bu FlowJo v7.5 gibi yazılım paketinin sitometri akışını kullanarak analiz için verileri analiz:
    1. İlk olarak, ileri (boyut) ve yan (granüllü yapı) göre kapı canlı HEK293 hücreleri dağıtır.
    2. Yalnızca transfekte hücreleri analiz etmek için yüksek GFP-pozitif göre daha fazla kapı canlı HEK293 hücreleri.
    3. Canlı GFP-pozitif hücreler içinde AF647 kanalın ortalama floresan yoğunluğu (MFI) belirler.
    4. Analiz için Excel veya prizma içine İhracat verileri:
       1. Plot cMFI karşı birincil antikor (anti-NMDAR veya anti-D2R antikor) oncentrations, bu antikorlar ile inkübe hücrelerden elde.
       2. Her bir hasta ve kontrol örneği için, sırası ile, HEK 293 ^{D2R +} ya da HEK293 ^{NMDAR +} hücrelerinin MFI gelen ^CTL HEK293 hücrelerinin MFI çıkarılarak ΔMFI belirler.
       3. Kontrol kohort ortalama ΔMFI yukarıdaki üç standart sapma ekleyerek antikor pozitifliğinin eşiğini hesaplayın.
       4. Arsa bireysel örnekler bir grafik üzerindeki serum türüne göre gruplandırılmış ve bir çizgi halinde eşiği temsil etmektedir.

Sonuçlar

Canlı HEK293 ^{D2R +} ve HEK293 hücreleri, ^CTL yüksek verimli bir örneği kullanarak akış sitometresi ile elde edildi. Analiz sırasında, hücreler ileri dağılım (boyut) ve yan dağılım (granülaritesi) parametreleri (Şekil 1A ve 1B) dayalı kapılı edilmiştir. Transfekte edilmiş HEK293 hücreleri sitoplazmasında raportör molekülü, GFP ifade ve transfekte edilmemiş hücrelerin analizi (Şekil 1 B ve 1 E) alınmad?...

Tartışmalar

Bu çalışma, bir yüksek verimli bir örneği kullanarak, belirli hücre yüzeyi proteinlerini nöronal hedef antikorları tespit etmek için bir canlı hücre bazlı bir deneyde akış sitometrisi yeni bir uygulamasını tarif etmektedir. Bu tekniği kullanarak, otoimmün sinir sistemi hastalığı olan etkilenen hastaların bir alt grubu NMDAR yüzey veya D2R yüzey serum antikorları sahip olduğunu bildirmektedir.

Canlı hücre bazlı bir deneyde sitometri bu yüksek verimli bir akış...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
pIRES2-EGFP vector	Clontech	6029-1
Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA	Missouri S&T cDNA Resource Centre	DRD020TN00
Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA			Gift from Prof A. Vincent  (Oxford, UK)
Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1)	BD Pharmingen	556308
Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11)	Sigma-Aldrich	WH0001813M1-50UG
Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L)	Invitrogen	A31571
Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L)	Invitrogen	A21445
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine and 110 mg/L sodium pyruvate	Invitrogen	11995-065
Foetal bovine serum	Invitrogen	10099-141
Gentamicin	Invitrogen	15710-072
GlutaMAX	Invitrogen	35050-061
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
Geneticin	Invitrogen	10131-035
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+)	Invitrogen	14190-144
TrypLE Express (1x) with Phenol Red	Invitrogen	12605-028
0.9% Sodium chloride	Baxter	AHF7975
Polyethylenimine	Polysciences Inc	9002-98-6
Versene	Invitrogen	15040-066
XhoI	Roche	10899194001
NheI	Roche	10885843001
PureLink PCR Purification Kit	Invitrogen	K3100-01
JetQuick Gel Extraction Spin Kit	Genomed	420050
T4 DNA Ligase	Roche	10481220001
Plasmid Plus Maxi Kit	Qiagen	12963
Name of Equipment/Software	Company	Catalog Number	Model/Version
Flow cytometer with high-throughput sampler system	BD Biosciences		BDLSRII with HTS
Inverted microscope	Olympus		CKX41 (with mercury lamp and U-RFLT50 power supply)
Electronic multichannel pipette (15-300 μl)	Eppendorf	613-2240P	12-channel Xplorer Plus
Excel	Microsoft		2010
Prism	GraphPad Software, Inc.		v4
FlowJo	Treestar		v7.5
50 ml polypropylene conical tubes	BD Biosciences	352070
6-well plate	BD Biosciences	353046
Tissue culture flask (T75)	BD Biosciences	353136
Parafilm	Pechiney Plastic Packaging	PM-992
V-bottom 96-well plate	Corning	651180