Высокая пропускная проточной цитометрии Клеточная Анализ для выявления антител к N-метил-D-аспартат рецепторов или допамин-2 рецепторов в сыворотке человека

Резюме

За последние годы, живые клеточных анализов были успешно использованы для выявления антител против поверхностных и конформационных антигенов. Здесь мы опишем метод с использованием высокой пропускной проточной цитометрии позволяет анализ больших группах пациентов. Обнаружение новых антител улучшит диагностику и лечение расстройств иммуноопосредованных.

Аннотация

За последние годы, антитела против поверхностных и конформационных белков, участвующих в синапсах были обнаружены в аутоиммунных заболеваний ЦНС у детей и взрослых. Эти антитела были использованы, чтобы направлять диагностику и лечение. Сотовые основе анализов улучшились обнаружение антител в сыворотке пациента. Они основаны на поверхностную экспрессию антигенов мозга на эукариотических клеток, которые затем инкубировали с разбавленной сывороткой пациента с последующим флуорохромом конъюгированные вторичные антитела. После промывки вторичное антитело связывания анализировали с помощью проточной цитометрии. Наша группа разработала поток высокой пропускной цитометрии живых клеток на основе анализа, чтобы надежно обнаружить антитела против специфических рецепторов нейромедиаторов. Этот метод проточной цитометрии является прямым, количественный, эффективной и использование системы отбора проб с высокой пропускной позволяет большие когорты пациентов, чтобы быть легко проанализированы в короткий промежуток времени. Кроме того, эта ячейка на основе каксказать можно легко адаптировать для выявления антител к различным антигенным целей, как из центральной нервной системы и периферии. Открывая дополнительные биомаркеров роман антител позволит быструю и точную диагностику и улучшить лечение нарушений иммуноопосредованных.

Введение

За последние годы, аутоиммунные формы центральной нервной системы (ЦНС) заболеваний выявлено не было. Было показано, что эти заболевания связаны и определяется наличием аутоантител. Эти антитела связываются с нейронных рецепторов или синаптических белков, участвующих в нейротрансмиссии ^1,2. Различные антигены были обнаружены, например, N-метил-D-аспартат рецепторов (NMDA-) ^3-5, γ-аминомасляной кислоты рецептора ГАМК B _(B) ^6, рецептор α-амино-3-гидрокси-5-метил-4- изоксазолпропионовой кислоты (АМРА) рецептору ^7, напряжения закрытого калиевых каналов (VGKC), связанные белки: лейцин-богатый глиома-активированный протеин 1 (LGL-1) и Contactin-ассоциированный белок 2 (capsr2) ^8,9, глутамат рецептора ^5,10 , и дофамин-2-рецептора (D2R) ^11. В прошлом эти аутоиммунные расстройства ЦНС (в основном называемые энцефалит) часто диагностируется и не лечится. Эти новые биомаркеры антител, напримерNMDA-антитело или D2R антитела, существенно улучшились диагностика и осведомленности, и открыли возможности для лечения пациентов. Действительно, в начале лечения с иммунотерапии связано с улучшением результатов ^11,12.

Традиционные методы для выявления антител, такие как иммуноферментного анализа (ELISA) и вестерн-блоттинга были использованы для выявления антител в сыворотках. Тем не менее, они не всегда позволяют признание внеклеточных или поверхностных эпитопов и, скорее, может выявить иммунореактивности к внутриклеточным эпитопа. Кроме того, антитела, которые связываются с внеклеточным доменом важных белков, участвующих в нейротрансмиссии, вероятно, будут патогенный ^2,3,7,13,14. Таким образом, развитие точных и чувствительных анализов, чтобы обнаружить соответствующую поверхность клеток или внеклеточных антител цели у пациентов имеет первостепенное значение. Способ золотым стандартом в этой области основана на использовании живых клеток, в так называемом "клеток-баSED анализы ". Этот метод предполагает выражение антигена на поверхности клеток млекопитающих (чаще всего человеческие эмбриональные почечные 293 (НЕК293) клеток) в своей нативной форме по трансфекции векторов, содержащих полную последовательность кДНК представляющим интерес антигеном. Текущие nonpermeabilized Клетки затем инкубировали с Разведенные образцы сыворотки и последующей флуорохромом-конъюгированного антитела против человеческого иммуноглобулина (Ig) вторичных антител. Интенсивность или уровень флуоресценции затем обнаружены и связан с уровнем аутоантител связывания. Этот метод является специфическим, так как только один антиген избыточно экспрессируется в клетках. Наиболее широко используется "для чтения отъезде" был конфокальной микроскопии анализ после иммуноцитохимии ^4,5,8-10. Тем не менее, проточной цитометрии клеточных анализов были успешно использованы для выявления антител у пациентов с демиелинизирующих заболеваний ^15-17. В частности, Waters и соавт. ¹⁵ по сравнению обнаружение антител с использованием поддонэль из методов обнаружения антител в том числе клеточных анализов, после чего микроскопии или проточной цитометрии анализа и показал проточной цитометрии на основе клеток анализе наиболее чувствительными, точными, и надежный способ. Таким образом, проточной цитометрии клеток на основе анализа является предпочтительным, поскольку это количественный, не зависящих исследователь, и не включает в себя любое использование радиоактивного материала. Это также удобно, так как позволяет большие когорты пациентов для анализа в короткий промежуток времени.

Совсем недавно, мы оптимизировали поток высокой пропускной цитометрии клеток на основе анализа для обнаружения NMDAR антитела и D2R антитела у пациентов с аутоиммунными заболеваниями ЦНС ^11. Наша группа недавно обнаружены NMDAR антитела в сыворотке пациента с помощью проточной цитометрии на основе клеток анализа. Эти NMDA-антитело-положительные сыворотки были предварительно проанализированы с помощью конфокальной микроскопии и также оказались положительными ^11. Этот протокол описывает проточной цитометрии на основе клеток анализа для обнаружения сonformation чувствительных ЦНС антитела в сыворотке пациента с использованием автоматизированной высокой пропускной сэмплер.

протокол

1. Субклонирование Стратегия построит pIRES2-EGFP вектор, кодирующий D2R или NMDAR

1. Получить полный рост клона кДНК человеческого D2R или NMDAR субъединицы 1 (NR1).
2. Выбрать вектор экспрессии, такой как pIRES2-EGFP, который подходит для экспрессии трансмембранных белков с повышенной зеленого флуоресцентного белка (GFP) репортер под контролем внутреннего сайта входа рибосомы (IRES), позволяя оба антигена и GFP быть совместной экспрессии в клетки отдельно.
3. Субклон кДНК человека в pIRES2-EGFP вектора.
   1. Для субклонировать кДНК, использовать соответствующие ферменты рестрикции (например NheI и XhoI для человека D2R кДНК).
   2. Перевязывать вырезать вставки кДНК в ограниченном pIRES2-EGFP вектора.
   3. Последовательность лигирована pIRES2-EGFP D2R или NMDAR вектор проверить вектор содержит ли правильную последовательность.
   4. Очищают и усилить pIRES2-EGFP D2R или NMDAR вектор для дальнейшего использования в трансфекции.

Заголовка "> 2. HEK293 сотовый Трансфекцию на выражение нейронов антигена

1. Культура HEK293 клетки в тканевых культуральных колбах со свежим Дульбекко в модификации Дульбекко (1x) (DMEM) в комплекте с 4,5 г / л D-глюкозы, L-глутамина и 110 мг / л пирувата натрия с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 2 мМ глютамаксом и 50 мкг / мл гентамицина.
2. Снять HEK293 клетки, используя трипсин и трансфер в конической трубе.
   1. Вымойте путем центрифугирования клетки при 250 мкг в течение 6 мин и ресуспендируют осадок клеток в свежей полной DMEM.
3. Граф клеток и семян 6-луночные планшеты около 8 х 10 ⁵ клеток / лунку и культуры в течение ночи в 2 мл DMEM при 37 ° С и 5% СО ₂ в инкубаторе.
4. После того, как они достигли около 70% слияния, трансфекции клеток HEK293 с pIRES2-EGFP NR1 (HEK293 ^{NMDAR +} клеток), pIRES2-EGFP D2R (HEK293 ^{D2R +} клеток), и pIRES2-EGFP (HEK293 ^CTL клетки; векторное управление) следующим образом.Держите некоторые нетрансфицированные HEK293 клетки для компенсации в дальнейшем.
   1. Подготовьте необходимый объем трансфекции смеси, включающей 2,5 мкг ДНК, 200 мкл 0,9% хлорида натрия и 4 мкг / мл полиэтиленимин / а (каждый из которых содержит 2 мл свежей полной DMEM).
   2. Сразу же вихрь смеси в течение 10 сек и инкубируют при комнатной температуре (RT) в течение 10 мин перед добавлением объем трансфекции смеси в соответствующие лунки.
   3. Закройте планшет, обернуть стороны парафильмом и центрифуге при 280 мкг в течение 5 мин, чтобы помочь трансфекции клеток.
   4. Снимите парафильмом, а затем поместить в инкубатор для культуры при 37 ° С
   5. Заменить питательных сред 18 часа спустя с свежей полной DMEM, и поддерживать в культуре еще 72 часа.
   6. Дополнительно: 72 часа после трансфекции трансфицированные клетки могут быть выбраны по культуре в полной среде DMEM, дополненной 250 мкг / мл генетицина, с тем чтобы получить стабильный поликлонального трансфектант.

3. Расход клеточном анализе цитометрии для определения антител к поверхностным нейронных антигены

1. Снять НЕК293 ^{NMDAR +,} HEK293 ^{D2R +} и HEK293 ^CTL клетки путем инкубации с 500 мкл / лунку версеном примерно 5 мин при 37 ° С
   1. Ресуспендируют в 2ml/well ФСБ (-Са ^{2 +} /-Mg ^{2 +)} с добавлением 2% FBS (PBS / FBS) и трансфер в 15 мл или 50 мл коническую трубку.
   2. Вымойте клеток путем центрифугирования при 250 мкг в течение 6 мин и ресуспендируют осадок клеток в 15-50 мл PBS / FBS. Повторите мыть 2 раза.
   3. Граф клеток, а затем ресуспендируют в PBS / FBS в 1 х 10 ⁶ клеток / мл.
2. Шаблон 96-луночного на приобретение проточной цитометрии, учитывая, что HEK293 ^{D2R +} или HEK293 ^{NMDA-+-клеток,} а также HEK293 клетки ^CTL должны быть инкубировали с каждого образца пациента или первичного антитела.
3. Семенной клеток в V дном 96-луночного планшета при 50000 клеток / WELL соответствии с проточной цитометрии шаблона приобретения.
4. Гранул клеток путем центрифугирования пластину 96-а при 450 мкг в течение 5 мин и осторожно удалите супернатант с помощью электронного или ручной многоканальную пипетку, наклоняя тарелку на угол, стараясь не для аспирации осадок клеток.
5. Выдержите НЕК293 ^{D2R +,} HEK293 ^{NMDAR +} и HEK293 ^CTL клетки в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте с:
   1. Серийные разведения первичного антитела в целях оценки экспрессии поверхностного антигена.
   2. Образцы пациентов с целью выявления антител.
6. Используйте соответствующий проточной цитометрии управления компенсационных, например. неокрашенные нетрансфицированные клетки HEK293, GFP ⁺ клетки HEK293 (AF647 ^-), и нетрансфицированные AF647 ⁺ клеток НЕК293 (GFP).
7. Промыть клетки центрифугированием при 450 х г в течение 5 мин и ресуспендируют осадок клеток в 170 мкл PBS / FBS. Повторите стирки Шаг второй более раз.
8. Инкубируйте клетки в течение 1 часаR при комнатной температуре в темноте с 1:100 разбавлении AF647-конъюгированным вторичным антителом (анти-человеческий IgG для сыворотки пациента и анти-мышиной IgG к анти-NR1 или анти-D2R первичными антителами).
9. Промыть клетки три раза, как на стадии 3.7, и ресуспендируют в 35 мкл PBS / FBS в течение проточной цитометрии привязки к соте.
10. Настройте высокой пропускной сэмплер (HTS) на проточном цитометре (BDLSRII).
11. Приобретать 10000 событий / а в соответствии с проточной цитометрии шаблона приобретения.
12. Экспорт, а затем анализировать данные для анализа с помощью проточной цитометрии программного пакета, например FlowJo v7.5:
    1. Во-первых, ворота живые клетки HEK293 на основе вперед (размер) и боковой (зернистость), тот расточает.
    2. Далее ворот живые клетки HEK293, основанные на высокой GFP-положительности для анализа только трансфекции клеток.
    3. Определяют интенсивность флуоресценции среднее (ИР), равный канала AF647 в живых GFP-положительных клеток.
    4. Экспорт данных в Excel или Prism для анализа:
       1. Участок сoncentrations первичного антитела (анти-NMDA-или анти-антителом D2R) по сравнению с MFI получены из клеток, инкубированных с этими антителами.
       2. Для каждого пациента и контрольного образца, определить ΔMFI путем вычитания MFI клеток HEK293 ^CTL от МФО в HEK293 ^{D2R +} или HEK293 ^{NMDAR +} клеток, соответственно.
       3. Рассчитать порог позитивности антител, добавив три стандартных отклонения выше среднего ΔMFI управляющего когорты.
       4. Образцы индивидуальных земля сгруппированы в соответствии с их типом сыворотки на графике и представляют порог в виде линии.

Результаты

Клетки живут HEK293 ^{D2R +} и HEK293 ^CTL были приобретены на проточном цитометре с использованием высокой пропускной сэмплер. Во время анализа, клетки закрытого на основе рассеяния вперед (размера) и боковой разброс (зернистость) параметров (рис. 1А и 1D). Трансфицирован...

Обсуждение

Эта статья описывает новую применение проточной цитометрии живых клеток на основе анализа для выявления антител, направленных на конкретные белки нервных клеточной поверхности с помощью высокой пропускной сэмплер. Используя эту технику, мы сообщаем, что подгруппа пациентов, страдаю?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
pIRES2-EGFP vector	Clontech	6029-1
Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA	Missouri S&T cDNA Resource Centre	DRD020TN00
Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA			Gift from Prof A. Vincent  (Oxford, UK)
Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1)	BD Pharmingen	556308
Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11)	Sigma-Aldrich	WH0001813M1-50UG
Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L)	Invitrogen	A31571
Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L)	Invitrogen	A21445
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine and 110 mg/L sodium pyruvate	Invitrogen	11995-065
Foetal bovine serum	Invitrogen	10099-141
Gentamicin	Invitrogen	15710-072
GlutaMAX	Invitrogen	35050-061
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
Geneticin	Invitrogen	10131-035
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+)	Invitrogen	14190-144
TrypLE Express (1x) with Phenol Red	Invitrogen	12605-028
0.9% Sodium chloride	Baxter	AHF7975
Polyethylenimine	Polysciences Inc	9002-98-6
Versene	Invitrogen	15040-066
XhoI	Roche	10899194001
NheI	Roche	10885843001
PureLink PCR Purification Kit	Invitrogen	K3100-01
JetQuick Gel Extraction Spin Kit	Genomed	420050
T4 DNA Ligase	Roche	10481220001
Plasmid Plus Maxi Kit	Qiagen	12963
Name of Equipment/Software	Company	Catalog Number	Model/Version
Flow cytometer with high-throughput sampler system	BD Biosciences		BDLSRII with HTS
Inverted microscope	Olympus		CKX41 (with mercury lamp and U-RFLT50 power supply)
Electronic multichannel pipette (15-300 μl)	Eppendorf	613-2240P	12-channel Xplorer Plus
Excel	Microsoft		2010
Prism	GraphPad Software, Inc.		v4
FlowJo	Treestar		v7.5
50 ml polypropylene conical tubes	BD Biosciences	352070
6-well plate	BD Biosciences	353046
Tissue culture flask (T75)	BD Biosciences	353136
Parafilm	Pechiney Plastic Packaging	PM-992
V-bottom 96-well plate	Corning	651180