Assay המבוסס תא זרימת cytometry תפוקה גבוהה לזיהוי נוגדנים לN-מתיל-D-aspartate קולטן דופמין או-2 קולטן בסרום אדם

Summary

במהלך השנים האחרונות, מבחני מבוססי תאים חיים כבר השתמשו בהצלחה כדי לזהות נוגדנים כנגד פני השטח ואנטיגנים קונפורמציה. כאן, אנו מתארים שיטה באמצעות זרימת cytometry תפוקה גבוהה המאפשר הניתוח של קבוצות גדולות של חולים. זיהוי של נוגדני רומן ישפר את האבחון וטיפול בהפרעות חיסונית בתיווך.

Abstract

במהלך השנים האחרונות, נוגדנים כנגד פני השטח וחלבונים המעורבים בקונפורמציה העצבית זוהו במחלות של מערכת העצבים המרכזית אוטואימונית בילדים ומבוגרים. נוגדנים אלה היו בשימוש כדי להדריך את האבחון וטיפול. מבחני מבוססי תאים שיפרו את זיהוי של נוגדנים בסרום חולה. הם מבוססים על הביטוי על פני השטח של מוח אנטיגנים על תאי אוקריוטים, אשר לאחר מכן מודגרת עם סרה מטופל מדוללת ואחריו נוגדנים משני fluorochrome-מצומדות. לאחר כביסה, נוגדנים משני מחייבים מנותחים לאחר מכן על ידי cytometry זרימה. הקבוצה שלנו פיתחה זרימת תפוקה גבוהה cytometry assay מבוסס תאים חיים כדי לזהות באופן מהימן נוגדנים כנגד קולטני הנוירוטרנסמיטר ספציפי. שיטת cytometry זרימה זו היא ישר קדימה, כמוני, יעיל, והשימוש במערכת סמפלר תפוקה גבוהה מאפשר למחזורי מטופל גדולים להיות assayed בקלות בפרק זמן קצר של זמן. בנוסף, זו המבוססת על תא כלומר ניתן להתאים בקלות לאיתור נוגדנים למטרות רבות ושונות אנטיגני, שניהם ממערכת העצבים המרכזית והפריפריה. גילוי סמנים ביולוגיים נוגדן רומן נוספים יאפשר אבחון מהיר ומדויק ולשפר את הטיפול בהפרעות חיסונית בתיווך.

Introduction

בשנים האחרונות, טפסים אוטואימונית של מערכת עצבים המרכזית מחלות (CNS) זוהו. הוכח כי מחלות אלה קשורים ומוגדרים על ידי הנוכחות של נוגדנים עצמיים. נוגדנים אלה נקשרים לקולטנים עצביים או חלבונים סינפטיים המעורבים ^ב1,2 העצבית. אנטיגנים שונים שכבר זוהו, כגון קולטן N-methyl-D-aspartate (NMDAR) ^3-5, חומצת B קולטן γ-aminobutyric _(GABA-B) קולטן ^6, α-אמינו-3-hydroxy-5-methyl-4- קולטן חומצת isoxazolepropionic (AMPA) ^7, ערוץ אשלגן תלוי מתח (VGKC) חלבונים הקשורים: חלבון לאוצין עשיר מופעלת גליומה 1 (LGL-1) וקשורים contactin החלבון 2 (capsr2) קולטן ^8,9, גלוטמט ^5,10 , ודופאמין-2 קולטן (D2R) ^11. בעבר, הפרעות אלה אוטואימונית של מערכת העצבים המרכזית (בעיקר בשם דלקת קרום המוח) היו לעתים קרובות לא מאובחנים ואינם מטופלים. סמנים ביולוגיים נוגדנים אלה רומן, למשלנוגדן NMDAR או נוגדן D2R, השתפר באופן משמעותי אבחנה ומודעות, ופתח אפשרויות טיפול בחולים. ואכן, טיפול מוקדם עם immunotherapies קשור בתוצאות משופרות ^11,12.

שיטות מסורתיות לאיתור נוגדנים, כגון assay enzyme-linked immunosorbent (ELISA) וכתם מערבי שימשו לזיהוי של נוגדנים בסרום. עם זאת, הם לא בקלות יאפשר זיהוי של אפיטופים תאיים או משטח ו, ולא, עשוי לחשוף immunoreactivity כלפי epitope תאיים. יתר על כן, נוגדנים שנקשרים לתחום תאי של חלבונים חשובים המעורבים בהעברה עצבית עשויים להיות ^2,3,7,13,14 פתוגניים. לכן, הפיתוח של מבחני מדויקים ורגישים כדי לגלות תא שטח רלוונטי או מטרות נוגדנים תאיים בחולים הוא בעל חשיבות עליונה. שיטת תקן זהב בתחום מתבססת על השימוש בתאים חיים, במה שמכונה "תא-baמבחני SED ". שיטה זו כרוכה בביטוי של אנטיגן על פני השטח של תאי יונקים (לרוב 293 תאים עובריים אנושיים בכליות (HEK293)) בצורה המקורית שלו על ידי transfection של וקטורים המכילים את רצף cDNA המלא של אנטיגן של עניין. לאחר מכן תאי nonpermeabilized בשידור חי מודגרת עם סרום מטופל מדולל ואחריו אימונוגלובולינים אנטי אנושיים fluorochrome מצומדות (איג) נוגדנים משני. העצמה או רמת הקרינה לאחר מכן זוהתה והיא קשורה לרמה של נוגדן מחייב. טכניקה זו היא ספציפית, אלא כאחד אנטיגן הוא ביטוי יתר בתאים. שימוש נרחב ביותר "לקריאה מתוך" כבר ניתוח מיקרוסקופיה confocal לאחר immunocytochemistry ^4,5,8-10. עם זאת, cytometry זרימת מבחני מבוססי תאים שימשה בהצלחה לאיתור נוגדנים בחולים עם מחלות demyelinating ^15-17. בפרט, ווטרס ואח'. ¹⁵ לעומת זיהוי של נוגדנים באמצעות מחבתאל של שיטות לזיהוי נוגדנים כוללים מבחני מבוססי תאים ואחריו במיקרוסקופ או cytometry זרימת מנתח, והוכיח cytometry זרימת assay מבוסס תאים להיות השיטה רגישה ביותר, מדויקת ואמינה. לכן, cytometry זרימת assay מבוסס תאים היא יתרון כפי שהיא כמוני, לא חוקר תלוי, ואינו כרוכים בשימוש בחומר רדיואקטיבי. זה גם נוח שכן היא מאפשרת מחזורי מטופל גדולים להיות מאושרים בפרק זמן קצר.

לאחרונה, יש לנו מותאם זרימת תפוקה גבוהה cytometry assay מבוסס תאים כדי לזהות נוגדני NMDAR ונוגדני D2R בחולים עם מחלות אוטואימוניות של מערכת העצבים המרכזית ^11. הקבוצה שלנו לאחרונה זוהתה נוגדני NMDAR בסרה מטופל באמצעות cytometry זרימת assay מבוסס תאים. סרום הנוגדנים חיוביים NMDAR אלה נותחו בעבר באמצעות מיקרוסקופיה confocal ונמצא גם להיות חיובי ^11. פרוטוקול זה מתאר cytometry זרימה assay מבוסס תאים לצורך זיהוי של גנוגדן onformation רגיש במערכת העצבים המרכזית בסרום חולה ניצול סמפלר תפוקה גבוהה אוטומטי.

Protocol

1. Subcloning אסטרטגיה לבניית pIRES2-EGFP וקטור הקידוד D2R או NMDAR

1. השג שיבוט cDNA באורך מלא של D2R אדם או למקטע NMDAR 1 (NR1).
2. בחר וקטור ביטוי, כגון pIRES2-EGFP, אשר מתאים לביטוי של חלבונים הטרנסממברני עם חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר כתב (GFP) תחת שליטה של ​​אתר פנימי הריבוזום כניסה (IRES), מה שמאפשר שני אנטיגנים וGFP להיות coexpressed ב תאים בנפרד.
3. Subclone cDNA האנושי בתוך וקטור pIRES2-EGFP.
   1. לsubclone cDNA, השתמש אנזימי הגבלה מתאימים (לדוגמא NheI וXhoI לאדם D2R cDNA).
   2. cDNA לחתוך ולקשור להכניס בתוך וקטור pIRES2-EGFP מוגבל.
   3. רצף ligated pIRES2-EGFP D2R או וקטור NMDAR כדי לבדוק אם הווקטור מכיל את הרצף הנכון.
   4. לטהר ולהגביר D2R pIRES2-EGFP או וקטור NMDAR לשימוש מאוחר יותר בtransfection.

itle "> 2. transfection תא HEK293 על ביטוי העצבי Antigen

1. תרבות תאי HEK293 בצלוחיות תרבית רקמה עם הנשר בינוני של Dulbecco הטרי השונה (1x) (DMEM) להשלים עם L / 4.5 גרם D-גלוקוז, L-גלוטמין ו110 מ"ג / פירובט נתרן L בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS), 2 מ"מ Glutamax, ו50 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין.
2. ניתוק תאי HEK293 באמצעות טריפסין והעברת צינור חרוטי.
   1. שטוף ידי צנטריפוגה תאים ב 250 XG במשך 6 דקות ו resuspend התא גלולה ב DMEM המלא הטרי.
3. ספירת התאים זרע 6 צלחות גם בסביבות 8 x 10 ⁵ תאים היטב / ותרבות הלילה בDMEM 2ml על 37 ° C ו 5% CO ₂ באינקובטור.
4. ברגע שהם הגיעו confluency סביב 70%, transfect HEK293 התאים עם pIRES2-EGFP NR1 (HEK293 ^{NMDAR +} תאים), pIRES2-EGFP D2R (HEK293 ^{D2R +} תאים), ו( HEK293 תאי ^CTL; בקרת וקטור) pIRES2-EGFP כדלקמן. לשמור על כמה תאי HEK293 untransfected לפיצוי בשלב מאוחר יותר.
   1. הכן את הנפח הנדרש של תערובת transfection הכולל 2.5 מיקרוגרם DNA, 200 μl 0.9% נתרן כלורי ו4 מיקרוגרם / מיליליטר polyethylenimine / טוב (כל אחד המכיל 2 מיליליטר DMEM להשלים טרי).
   2. מייד מערבולת התערובת ל10 שניות ו דגירה בטמפרטורת חדר (RT) עבור 10 דקות, לפני שמוסיף נפח של תערובת transfection לבארות המתאימות.
   3. מכסה את הצלחת, לעטוף את הצדדים עם Parafilm, ו צנטריפוגות ב XG 280 למשך 5 דקות כדי לסייע transfection תא.
   4. הסר את Parafilm ולאחר מכן למקם בחממה לתרבות ב 37 ° C.
   5. החלף תקשורת תרבות 18 שעה מאוחר יותר עם DMEM המלא טרי, ולשמור בתרבות לעוד 72 שעה.
   6. אופציונאלי: לאחר transfection 72 שעה, ניתן לבחור תאי transfected על ידי התרבות בDMEM המלא בתוספת 250 מיקרוגרם / מיליליטר Geneticin, על מנת לקבל transfectant יציב polyclonal.

class = "jove_title"> 3. לזרום assay המבוסס תא Cytometry לאיתור של נוגדנים לאנטיגנים במשטח עצביים

1. ניתוק HEK293 ^{NMDAR +,} HEK293 ^{D2R +,} וHEK293 תאי ^CTL על ידי דגירה עם 500 μl / טוב Versene למשך כ 5 דקות על 37 ° C.
   1. Resuspend ב 2ml/well של PBS (-Ca ^{2 +} /-Mg ^{2 +)} בתוספת 2% FBS (PBS / FBS) והעברה ל15 מיליליטר או 50 מיליליטר צינור חרוטי.
   2. שטפו תאים על ידי צנטריפוגה ב250 XG במשך 6 דקות ו resuspend התא גלולה ב 15-50 מיליליטר PBS / FBS. חזור על לשטוף 2x.
   3. ספירת התאים ולאחר מכן resuspend ב PBS / FBS ב1 x 10 ⁶ תאים / מיליליטר.
2. עיצוב תבנית 96, גם לרכישת cytometry הזרימה, בהתחשב בכך שHEK293 ^{D2R +} או HEK293 ^{NMDAR +} תאים, כמו גם תאי HEK293 ^CTL יהיו חייבים להיות הודגרו עם כל דגימת חולה או נוגדן ראשוני.
3. תאי זרע בצלחת 96 היטב V-תחתון ב50,000 תאים /ll פי cytometry זרימת תבנית רכישה.
4. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה צלחת 96 היטב ב450 XG במשך 5 דקות ולהסיר בעדינות את supernatant באמצעות פיפטה רבה אלקטרונית או ידנית, מטה את הצלחת על זווית ונזהר שלא לשאוב את התא גלולה.
5. דגירה HEK293 ^{D2R +,} HEK293 ^{NMDAR +,} וHEK293 תאי ^CTL עבור שעה 1 ב RT בחושך עם:
   1. דילולים סדרתי של נוגדן ראשוני על מנת להעריך את הביטוי על פני השטח אנטיגן.
   2. דגימות חולה כדי לזהות נוגדנים.
6. השתמש בזרימה מתאימה cytometry בקרות פיצוי, למשל. תאי HEK293 untransfected בלא כתם, ה-GFP ⁺ HEK293 תאים (AF647 ^-), וAF647 ⁺ HEK293 תאי untransfected (GFP).
7. שטפו תאים על ידי צנטריפוגה ב450 XG במשך 5 דקות ו resuspend התא גלולה ב μl 170 PBS / FBS. חזור על שלב לשטוף פעמים נוספות.
8. דגירה תאים עבור h 1r ב RT בחושך עם 1:100 דילול של נוגדנים משני AF647 מצומדות (IgG אנטי אנושי לסרום מטופל ואנטי העכבר IgG לנוגדנים עיקריים נגד NR1 או אנטי D2R).
9. לשטוף את התאים שלוש פעמים, כמו בשלב 3.7, ו resuspend ב35 μl PBS / FBS עבור cytometry זרימת רכישת תא.
10. הגדרת סמפלר התפוקה גבוהה (HTS) על cytometer הזרימה (BDLSRII).
11. לרכוש 10,000 אירועים / טוב פי cytometry זרימת תבנית רכישה.
12. יצוא ולאחר מכן לנתח את הנתונים לניתוח באמצעות cytometry זרימת חבילת תוכנה, כגון v7.5 FlowJo:
    1. ראשית, שער HEK293 התאים חיים המבוסס על קדימה (גודל) וצד (גרעיניות) מפזר.
    2. תאי שער נוסף חיים HEK293 מבוססים על ה-GFP-חיוביות גבוהה לנתח רק את תאי transfected.
    3. לקבוע את עוצמת הקרינה הממוצעת (MFI) של ערוץ AF647 בתוך התאים GFP חיובי בשידור חי.
    4. נתוני יצוא לאקסל או פריזמה לניתוח:
       1. מגרש גoncentrations של נוגדן ראשוני (אנטי NMDAR או נוגדן אנטי D2R) לעומת MFI המתקבל מהתאים הודגרו עם נוגדנים אלה.
       2. עבור כל דגימת חולה ובקרה, לקבוע את ΔMFI ידי הפחתת MFI של HEK293 תאי ^CTL מMFI של HEK293 ^{D2R +} או HEK293 ^{NMDAR +} תאים, בהתאמה.
       3. לחשב את הסף של חיוביות נוגדנים על ידי הוספת שלוש סטיות תקן מעל ΔMFI הממוצע של קבוצת הביקורת.
       4. דגימות בודדות עלילה קובצו לפי סוג הדם שלהם על גרף ומייצגות את הסף כקו.

תוצאות

תאי חי HEK293 ^{D2R +} וHEK293 ^CTL נרכשו בcytometer הזרימה באמצעות סמפלר תפוקה גבוהה. במהלך ניתוח, תאים היו מגודרות המבוססים על פיזור קדימה (גודל) ופיזור בצד פרמטרים (גרעיניות) (איורים 1 א ו1D). HEK293 תאי transfected הביעו מולקולת הכתב, ה-GFP, בציטופלסמה, ותאי untransfected הוצאו מנית...

Discussion

מאמר זה מתאר יישום רומן של cytometry זרימת assay מבוסס תאים חיים כדי לזהות נוגדני מיקוד חלבונים עצביים תא שטח ספציפיים באמצעות סמפלר תפוקה גבוהה. באמצעות טכניקה זו, אנו מדווחים כי תת קבוצה של חולים שנפגעו במחלות במערכת העצבים המרכזית אוטואימוניות יש נוגדנים בסרום על פני הש?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
pIRES2-EGFP vector	Clontech	6029-1
Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA	Missouri S&T cDNA Resource Centre	DRD020TN00
Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA			Gift from Prof A. Vincent  (Oxford, UK)
Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1)	BD Pharmingen	556308
Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11)	Sigma-Aldrich	WH0001813M1-50UG
Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L)	Invitrogen	A31571
Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L)	Invitrogen	A21445
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine and 110 mg/L sodium pyruvate	Invitrogen	11995-065
Foetal bovine serum	Invitrogen	10099-141
Gentamicin	Invitrogen	15710-072
GlutaMAX	Invitrogen	35050-061
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
Geneticin	Invitrogen	10131-035
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+)	Invitrogen	14190-144
TrypLE Express (1x) with Phenol Red	Invitrogen	12605-028
0.9% Sodium chloride	Baxter	AHF7975
Polyethylenimine	Polysciences Inc	9002-98-6
Versene	Invitrogen	15040-066
XhoI	Roche	10899194001
NheI	Roche	10885843001
PureLink PCR Purification Kit	Invitrogen	K3100-01
JetQuick Gel Extraction Spin Kit	Genomed	420050
T4 DNA Ligase	Roche	10481220001
Plasmid Plus Maxi Kit	Qiagen	12963
Name of Equipment/Software	Company	Catalog Number	Model/Version
Flow cytometer with high-throughput sampler system	BD Biosciences		BDLSRII with HTS
Inverted microscope	Olympus		CKX41 (with mercury lamp and U-RFLT50 power supply)
Electronic multichannel pipette (15-300 μl)	Eppendorf	613-2240P	12-channel Xplorer Plus
Excel	Microsoft		2010
Prism	GraphPad Software, Inc.		v4
FlowJo	Treestar		v7.5
50 ml polypropylene conical tubes	BD Biosciences	352070
6-well plate	BD Biosciences	353046
Tissue culture flask (T75)	BD Biosciences	353136
Parafilm	Pechiney Plastic Packaging	PM-992
V-bottom 96-well plate	Corning	651180