인간 혈청에있는 N-메틸-D-아스파 라진 산염 수용체 또는 도파민 2 수용체에 대한 항체를 검출하는 높은 처리량 유동 세포 계측법 세포 기반 분석

요약

최근 몇 년 동안, 살아있는 세포 기반 분석은 표면과 형태 적 항원에 대한 항체를 검출하기 위해 성공적으로 사용되어왔다. 여기서, 우리는 많은 환자 코호트의 분석을 가능 계측법 높은 처리량의 흐름을 사용하는 방법을 설명한다. 새로운 항체의 검출은 면역 매개 질환의 진단과 치료를 향상시킬 것입니다.

초록

최근 몇 년 동안, 표면 및 신경 전달에 관여 구조적 단백질에 대한 항체는 어린이와 성인자가 면역 CNS 질환에서 검출되었다. 이 항체는 진단과 치료를 안내하는 데 사용되었습니다. 세포 기반 분석은 환자의 혈청에서 항체의 검출을 개선했습니다. 그들은 다음 형광 색소 - 복합 이차 항체 다음에 희석 한 환자의 혈청으로 배양하는 진핵 세포에서 뇌 항원의 표면 발현을 기반으로합니다. 세탁 후, 바인딩 차 항체는 다음 유동 세포 계측법에 의해 분석된다. 우리 그룹은 안정적으로 특정 신경 전달 물질 수용체에 대한 항체를 검출하는 살아있는 세포 기반 분석 세포 계측법 높은 처리량의 흐름을 개발했다. 이 유동 세포 계측법 방법 곧장 앞으로, 양적, 효율적이며, 많은 환자 코호트 쉽게 짧은 시간으로 측정 될 수 있도록 높은 처리량 샘플러 시스템의 사용을 허용한다. 또한,이 같은 셀 기반말할 간단 중추​​ 신경계 및 말초 신경계 모두에서 많은 다른 항원 표적으로하는 항체를 검출하도록 구성 될 수있다. 추가로 새로운 항체 바이오 마커를 발견하는 것은 신속하고 정확한 진단을 가능하게하고 면역 매개 질환의 치료를 향상시킬 것입니다.

서문

최근 몇 년 동안, 중추 신경계 (CNS) 질병의 면역 형태가 확인되었다. 이들 질환과 연관된자가 항체의 존재에 의해 정의되는 것으로 밝혀졌다. 이 항체는 신경 세포의 수용체 나 신경 전달의 ^1,2에 관련된 시냅스 단백질에 결합한다. 다른 항원은 N-메틸-D-아스파 테이트 수용체 (NMDAR) ^3-5, γ-아미노 낙산의 B 수용체 (GABA의 _B) 수용체 ^6, α-아미노 -3 - 히드 록시 -5 - 메틸 -4 -로서, 탐지 된 isoxazolepropionic 산 (AMPA) 수용체 ^7, 전압 - 문이 칼륨 채널 (VGKC) 관련 단백질 : 류신이 풍부한 신경 교종 활성 단백질 1 (LGL-1) contactin 관련 단백질 2 (capsr2) ^8,9, 글루타민산 염 수용체 ^5,10 , 그리고 도파민 2 수용체 (D2R) ^11. 과거에는 (주로 뇌염이라는) 이러한자가 면역 CNS 장애는 종종 진단되지 및 치료했다. 이 소설 항체 바이오 마커, 예를 들어,NMDAR의 항체 또는 D2R 항체는 실질적으로 진단과 인식을 개선하고, 환자에 대한 치료 옵션을 열었습니다. 사실, 면역 요법과 조기 치료가 개선 된 결과 ^{(11, 12)와} 연결되어 있습니다.

이러한 효소 결합 면역 분석 (ELISA)과 웨스턴 블롯으로 항체를 검출하는 전통적인 방법은 혈청에있는 항체의 검출에 사용되었다. 그러나, 그들은 쉽게 세포 또는 표면 항원의 인식을 사용하지 않고, 오히려 세포 내 항원으로 면역 반응을 보여줄 수 있습니다. 또한, 신경 전달에 관련된 중요한 단백질의 세포 외 도메인에 결합하는 항체는 병원성 ^2,3,7,13,14 될 가능성이있다. 따라서, 관련 세포 표면 또는 환자의 세포 항체 표적을 발견 할 수있는 정확하고 민감한 분석의 개발이 가장 중요하다. 필드 금 표준 방법은 소위 "휴대 BA에서, 생균의 사용에 기초SED 분석 ". 이 방법은 또한 포유 동물 세포의 항원의 완전한 cDNA의 서열을 함유하는 벡터의 형질 감염에 의해 네이티브 형태 (대부분 인간 배아 신장 293 (HEK293) 세포)의 표면 항원의 발현을 포함한다. 라이브 nonpermeabilized 세포는 다음 희석 된 환자의 혈청 배양 및 형광 색소 - 복합 항 - 인간 면역 글로불린 (ig으로) 이차 항체에 의해 따른다. 형광의 강도 또는 레벨은 검출되고 결합자가 항체의 수준으로 연관된다. 하나의 항원이 세포에서 과다 발현으로이 기술은 고유합니다. 가장 널리 "판독"을 사용은 면역 세포 화학 ^4,5,8-10 후 공 초점 현미경 분석하고있다. 그러나, 세포 기반 분석 유동 세포 계측법을 성공적으로 탈수 초성 질환 ^{15 ~ 17} 환자에서 항체를 감지하는 데 사용되었다. 특히, 워터스 외. ^15은 팬을 사용하여 항체의 검출을 비교셀 기반 현미경으로 다음 분석이나 흐름 등의 항체 검출 기술의 엘 세포 계측법 분석하고, 가장 민감한 정확하고 신뢰할 수있는 방법으로 세포 기반 분석 유동 세포 계측법 보여 주었다. 그것은 조사 의존 정량없고, 방사성 물질의 사용을 포함하지 않는 때문에, 세포 기반 분석법 유세포 유리하다. 이 큰 환자의 코호트는 단시간으로 측정 할 수로서 또한 편리하다.

더 최근에, 우리는 면역 CNS 질환 환자 ¹¹ NMDAR 항체 및 D2R 항체를 검출하는 세포 기반 분석 계측법 높은 처리량의 흐름을 최적화했다. 우리 그룹은 최근 세포 기반 분석 유동 세포 계측법을 사용하여 환자의 혈청에서 NMDAR 항체를 발견했습니다. 이러한 NMDAR 항체 - 양성 혈청 기계 공 촛점 현미경을 사용하여 분석하고, 또한 ¹¹ 개의 긍정적 인 것으로 밝혀졌다. 이 프로토콜은 C의 탐지를위한 세포 기반 분석 유동 세포 계측법을 설명자동 높은 처리량 샘플러를 이용하여 환자의 혈청에서 onformation 민감한 CNS 항체.

프로토콜

1. 전략 pIRES2-EGFP 벡터 인코딩 D2R 또는 NMDAR을 구성하는 서브 클로닝

1. 인간 D2R 또는 NMDAR의 서브 유닛 1 (NR1)의 전체 길이의 cDNA 클론을 구하십시오.
2. 등의 동시 발현되는 항원 및 GFP를 모두 가능하게하는 강화 된 녹색 형광 단백질 내부 ribosome 항목 사이트 (IRES)의 통제하에 (GFP) 기자와 횡단 단백질의 발현에 적합한 pIRES2-EGFP와 같은 발현 벡터를 선택 별도 세포.
3. pIRES2-EGFP 벡터 내에서 인간의 cDNA를 서브 클론.
   1. cDNA를 서브 클로닝 적절한 제한 효소를 사용하려면 (인간 D2R cDNA를 예를 들어 NHEI 및 XhoI에 대한).
   2. 결찰 컷 cDNA를 제한 pIRES2-EGFP 벡터 내에 삽입합니다.
   3. 순서는 벡터가 올바른 순서로 포함되어 있는지 여부를 확인하기 위해 pIRES2-EGFP D2R 또는 NMDAR 벡터를 결찰.
   4. 정화 및 형질에 나중에 사용하기 위해 pIRES2-EGFP의 D2R 또는 NMDAR 벡터를 증폭.

itle "> 2. 신경 세포 항원의 발현에 대한 HEK293 세포 형질

1. 신선한 둘 베코 변형 이글 매체 (1X) (DMEM) 4.5 g / L에 D-글루코오스, L-글루타민 및 110 mg의 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 / L 피루브산 나트륨 완전한 가진 조직 배양 플라스크에서 배양 HEK293 세포 2 ㎜ 루타, 50 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신.
2. 트립신 및 전송을 원뿔 튜브를 사용하여 HEK293 세포를 분리합니다.
   1. 6 분 250 XG에서 세포를 원심 분리하여 세척하고 신선한 완전한 DMEM에있는 세포 펠렛을 resuspend.
3. 약 8 × 10 ⁵ 세포 / 웰과 문화 하룻밤 2 ML DMEM에서 37 ° C에서 5 % 인큐베이터에서 CO _2의 세포와 씨앗 6 웰 플레이트를 계산합니다.
4. 그들은 약 70 %의 포화 상태에 도달 한 후, pIRES2-EGFP NR1 (HEK293 ^{NMDAR +} 세포), pIRES2-EGFP D2R (HEK293 ^{D2R +} 세포)와 HEK293 세포를 형질 및 pIRES2-EGFP (HEK293 ^{CTL 세포,} 벡터 제어)은 다음과 같이.나중에 보상에 대한 몇 가지 형질 감염되지 않은 HEK293 세포를 유지합니다.
   1. 2.5 μg DNA, 200 ㎕의 0.9 % 염화나트륨 및 4 ㎍ / ml의 폴리에틸렌 이민 / 웰 (각 2 ㎖ 신선한 완전 DMEM을 포함)를 포함하는 형질 전환 혼합물의 필요한 양을 준비한다.
   2. 즉시 10 초 동안 혼합하고 와동 적절한 웰에 형질 전환 혼합물의 양을 첨가하기 전에, 10 분 동안 실온 (RT)에서 배양한다.
   3. , 플레이트를 커버 파라 필름과 측면을 감싸, 세포 형질 전환을 지원하기 위해 5 분 280 XG에 원심 분리기.
   4. 파라 필름을 제거한 후 37 ℃에서 문화 인큐베이터에 배치
   5. 신선한 완전한 DMEM으로 18 시간 후 배양 배지를 교체하고 또 다른 72 시간 동안 문화를 유지한다.
   6. 선택적 : 72 시간 후 - 형질 감염, 형질 전환 된 세포는 형질 안정한 클론을 얻기 위해, 250 ㎍ / ml의 제 네티 신으로 보충 된 완전 DMEM에 배양하여 선택 될 수있다.

3. 신경 세포의 항원을 표면에 항체의 검출을위한 세포 계측법 세포 기반 분석 흐름

1. 37 ° C에서 약 5 분 동안 500 μL / 잘 센과 배양 HEK293 ^{NMDAR +,} HEK293 ^{D2R +} 및 HEK293 ^{CTL 세포를} 분리
   1. PBS의 2ml/well에 재현 탁 (-CA ^{2 +} / -의 Mg ^{2 +)} 2 % FBS (PBS / FBS) 및 15 ㎖의 50 ML 원뿔 튜브로 전송 보충.
   2. 6 분 250 XG에서 원심 분리하여 세포를 세척하고 15 ~ 50 ㎖의 PBS / FBS에있는 세포 펠렛을 resuspend. 세척 배를 반복합니다.
   3. 세포를 계산 한 후 1 × 10 ⁶ 세포 / ml에서 PBS / FBS에 재현 탁.
2. HEK293 ^{D2R +} 또는 HEK293 ^{NMDAR +} 세포뿐만 아니라, HEK293 ^{CTL 세포가} 각각의 환자 샘플 또는 기본 항체와 함께 배양 할 수있을 것이라는 점을 고려하여, 유동 세포 계측법 획득을위한 96 - 웰 템플릿을 디자인합니다.
3. 50,000 세포 / 우리의 V-바닥 96 - 웰 플레이트의 씨앗 세포LL 취득 템플릿 유동 세포 계측법에있어서.
4. 5 분 450 XG에 96 - 웰 플레이트를 원심 분리하고 부드럽게 전자 또는 수동 멀티 채널 피펫을 사용하여 상층 액을 제거, 각도에 접시를 기울 세포 펠렛을 대기음되지 않도록주의하여 세포 펠렛.
5. HEK293 ^{D2R +,} HEK293 ^{NMDAR +,} 그리고 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 HEK293 ^CTL의 세포를 품어 :
   1. 항원 표면 발현을 평가하기 위해 차 항체의 희석으로.
   2. 항체를 검출하기 위해 환자 샘플.
6. 예를 들어, 보상 컨트롤 세포 계측법 적절한 흐름을 사용합니다. 형질 감염되지 않은 흠 HEK293 세포, GFP ⁺ HEK293 세포 (AF647 ^-) 및 형질 감염되지 않은 AF647 ⁺ HEK293 세포 (GFP).
7. 5 분 450 XG에서 원심 분리하여 세포를 세척하고 170 ㎕의 PBS / FBS에있는 세포 펠렛을 resuspend. 세척 단계 두 개 더 번 반복합니다.
8. 1 시간 동안 세포를 품어(안티 NR1 또는 항 D2R 차 항체 환자의 혈청과 항 - 마우스 IgG 안티 인간 IgG) AF647 - 복합 이차 항체의 1:100 희석 어둠 속에서 실온에서 연구.
9. 단계 3.7에서와 같이 세포를 세 번 씻어 셀 획득 유동 세포 계측법에 35 ㎕의 PBS / FBS에 재현 탁.
10. (BDLSRII) 흐름 cytometer에 높은 처리량 샘플러 (HTS)을 설정합니다.
11. 인수 템플릿 유동 세포 계측법에 따라 10,000 / 잘 취득.
12. 수출 다음과 같은 FlowJo의 V7.5와 같은 소프트웨어 패키지 유동 세포 계측법을 사용하여 분석을 위해 데이터를 분석 :
    1. 첫째, 앞으로 (크기) 및 측면 (단위)에 따라 게이트 라이브 HEK293 세포를 없앤다.
    2. 만 형질 전환 세포를 분석 할 수있는 높은 GFP - 양성에 따라 더 게이트 라이브 HEK293 세포.
    3. 라이브 GFP 양성 세포 내에 AF647 채널의 평균 형광 강도 (MFI)를 결정한다.
    4. 분석을 위해 Excel 또는 프리즘에 데이터 내보내기 :
       1. 플롯 CMFI 대 차 항체 (항-NMDAR 또는 항-D2R 항체)의 oncentrations는이 항체와 함께 배양 세포에서 얻은.
       2. 각 환자 및 컨트롤 샘플은 각각 HEK293 ^{D2R +} 또는 HEK293 ^{NMDAR +} 세포의 MFI에서 ^CTL HEK293 ^세포의 MFI를 감산함으로써 ΔMFI를 결정한다.
       3. 제어 일대의 평균 ΔMFI 위의 세 가지 표준 편차를 추가하여 항체 양성의 임계 값을 계산합니다.
       4. 플롯 개별 샘플은 그래프에서 혈청 형에 따라 그룹화하고 라인으로서 임계 값을 나타낸다.

결과

라이브 HEK293 ^{D2R + CTL} 및 HEK293 세포는 높은 처리량 샘플러를 사용하여 유동 세포 계측기로 획득 하였다. 분석하는 동안, 세포는 앞으로 분산 형 (크기)와 사이드 분산 형 (단위) 매개 변수 (그림 1A와 1D)를 기반으로 문이되었다. 형질 감염된 HEK293 세포는 세포질에서 리포터 분자, GFP를 발현하고, 형질 감염되지 않은 세포를 분석 (도 1B 및 1E)에서 제외 하였...

토론

본 논문은 높은 처리량 샘플러를 사용하여 특정 세포 표면의 연결 단백질을 표적으로하는 항체를 검출하는 살아있는 세포 기반 분석 유동 세포 계측법의 새로운 응용 프로그램을 설명합니다. 이 기술을 사용하여, 우리는 면역 CNS 질환으로 영향을 환자의 서브 그룹 NMDAR으로 표면 또는 표면 D2R하는 혈청 항체를 가지고 있음을보고한다.

살아있는 세포 기반 분석법 계측법이 높...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
pIRES2-EGFP vector	Clontech	6029-1
Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA	Missouri S&T cDNA Resource Centre	DRD020TN00
Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA			Gift from Prof A. Vincent  (Oxford, UK)
Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1)	BD Pharmingen	556308
Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11)	Sigma-Aldrich	WH0001813M1-50UG
Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L)	Invitrogen	A31571
Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L)	Invitrogen	A21445
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine and 110 mg/L sodium pyruvate	Invitrogen	11995-065
Foetal bovine serum	Invitrogen	10099-141
Gentamicin	Invitrogen	15710-072
GlutaMAX	Invitrogen	35050-061
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
Geneticin	Invitrogen	10131-035
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+)	Invitrogen	14190-144
TrypLE Express (1x) with Phenol Red	Invitrogen	12605-028
0.9% Sodium chloride	Baxter	AHF7975
Polyethylenimine	Polysciences Inc	9002-98-6
Versene	Invitrogen	15040-066
XhoI	Roche	10899194001
NheI	Roche	10885843001
PureLink PCR Purification Kit	Invitrogen	K3100-01
JetQuick Gel Extraction Spin Kit	Genomed	420050
T4 DNA Ligase	Roche	10481220001
Plasmid Plus Maxi Kit	Qiagen	12963
Name of Equipment/Software	Company	Catalog Number	Model/Version
Flow cytometer with high-throughput sampler system	BD Biosciences		BDLSRII with HTS
Inverted microscope	Olympus		CKX41 (with mercury lamp and U-RFLT50 power supply)
Electronic multichannel pipette (15-300 μl)	Eppendorf	613-2240P	12-channel Xplorer Plus
Excel	Microsoft		2010
Prism	GraphPad Software, Inc.		v4
FlowJo	Treestar		v7.5
50 ml polypropylene conical tubes	BD Biosciences	352070
6-well plate	BD Biosciences	353046
Tissue culture flask (T75)	BD Biosciences	353136
Parafilm	Pechiney Plastic Packaging	PM-992
V-bottom 96-well plate	Corning	651180